5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN
3.3.1.Ảnh hưởng của dịch chiết nấm men
3.3.1.1. Sinh trưởng tế bào
Từ các thí nghiệm nuôi cấy tế bào huyền phù, công thức tích lũy sinh khối và oleanolic acid tốt nhất là cơ bản MS chứa 1 mg/L BAP và 0,5 mg/L 2,4-D (Bảng 3.7). Do đó, nghiên cứu ảnh hưởng của các elicitor lên khả năng sản xuất oleanolic acid được thực hiện trên môi trường này.
Kết quả nghiên cứu trình bày ở bảng 3.9 cho thấy, YE đã ảnh hưởng lên sinh trưởng tế bào. Khi bổ sung YE vào thời điểm ban đầu (0 ngày), ở tất cả các nồng độ thử nghiệm sinh trưởng của tế bào đinh lăng lá nhỏ đều bị ức chế
so với đối chứng. Sinh khối tươi giảm nhiều (1,54-1,81 g/bình) so với đối chứng là 6,37 g/bình. Sinh khối khô cũng có sự thay đổi có ý nghĩa thống kê giữa các công thức xử lý elicitor (0,20-0,26 g) so với đối chứng 0,39 g (p<0,05). Nhìn chung, nồng độ YE càng cao thì sinh trưởng tế bào càng giảm.
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của YE lên sinh trưởng của tế bào đinh lăng lá nhỏ.
Nồng độ (g/L)
Thời điểm (ngày)
Khối lượng tế bào
(g/bình) GI Trạng thái Tươi Khô ĐC 6,37a 0,39a 3,19a Vàng xanh, cứng, có hóa nâu (rất ít) 0 1,81e 0,26d 0,91c Nâu đậm, dai 3 2,34d 0,30c 1,17c Nâu, dai 1 6 5,05b 0,48a 2,52b Vàng xanh, cứng 9 6,12a 0,46a 3,06a Vàng xanh, cứng 0 1,72e 0,22d 0,86c Nâu đậm hơn, dai 3 2,16d 0,28cd 1,08c Nâu đậm, dai 2
6 3,88c 0,44b 1,94b Vàng, nâu, cứng 9 3,90c 0,47a 1,95c Vàng, nâu ít, cứng 0 1,54e 0,20d 0,77c Nâu đen, dai 3 1,73e 0,27cd 0,87c Nâu đen, dai 3
6 3,31c 0,39bc 1,66bc Nâu, vàng, cứng 9 3,54b 0,46a 1,77bc Nâu, vàng, cứng
Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ ra sự sai khác có mức ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p<0,05 (Duncan’s test). ĐC: đối chứng không bổ sung elicitor
Chỉ số sinh trưởng của tế bào (GI) cũng thay đổi tương tự như sinh khối tế bào, bổ sung nồng độ YE càng cao thì sinh trưởng tế bào càng giảm và
khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Trong đó, ở 3 g/L YE, sinh trưởng tế bào giảm khoảng 4 lần so với đối chứng (0,77 so với 3,19).
Tại các thời điểm bổ sung sau 3, 6 và 9 ngày nuôi cấy, sinh trưởng tế bào cao hơn so với thời điểm bổ sung lúc bắt đầu nuôi cấy. Số ngày tế bào được xử lý YE tỷ lệ nghịch với sự sinh trưởng, điều này có nghĩa là số ngày tế bào được cảm ứng càng ít thì sinh trưởng tế bào càng ít bị ức chế. Như vậy, tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ sinh trưởng tốt nhất khi bổ sung YE với nồng độ 1, 2, 3 g/L lần lượt sau 9 ngày nuôi cấy. Về trạng thái vật lý, tế bào sẽ có màu nâu đậm và mềm hơn khi thời gian tác dụng với YE càng dài. Thời điểm xử lý elicitor là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng tích lũy các sản phẩm thứ cấp của tế bào thực vật.
Do sinh trưởng của tế bào ít bị ức chế khi thời gian xử lý elicitor ngắn, nên GI ở các công thức thí nghiệm tăng dần từ thời điểm bổ sung YE ban đầu cho đến thời điểm bổ sung vào ngày thứ 9, và nồng độ YE bổ sung càng thấp thì GI càng cao. GI có giá trị thấp nhất khi bổ sung 3 g/L YE vào thời điểm ban đầu nuôi cấy (0,77) và cao nhất khi bổ sung 1 g/L YE vào ngày nuôi cấy thứ 9 (3,06), thấp hơn so với đối chứng (3,19). Các hình 3.9 và 3.10 minh họa sinh khối tế bào khi được xử lý YE ở các nồng độ và thời điểm khác nhau.
3.3.1.2. Hàm lượng oleanolic acid
Khi bổ sung YE ở các nồng độ khác nhau vào môi trường nuôi cấy hàm lượng oleanolic acid đã tăng lên đáng kể so với đối chứng, trong đó thời điểm 6 ngày cho hàm lượng cao nhất ở tất cả các nồng độ của YE.
Ở môi trường bổ sung 1 g/L YE khối lượng khô của tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ đạt cao nhất (0,48 g/bình) (Bảng 3.9), sinh tổng hợp oleanolic acid đã tăng lên 6,47 lần so với đối chứng không bổ sung elicitor (78,55 mg/bình). Bổ sung 2 g/L YE vào ngày thứ 6, hàm lượng oleanolic acid tăng lên đáng kể, gấp 3,89 lần đối chứng (43,18 mg/bình). Khi tăng nồng độ
YE, hàm lượng oleanolic acid cũng tăng lên nhưng không cao bằng các công thức bổ sung YE nồng độ thấp. Ở công thức bổ sung 3 g/L YE, hàm lượng oleanolic acid cũng cao gấp 2,55 lần đối chứng (Bảng 3.10).
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của YE lên tích lũy oleanolic acid của tế bào đinh lăng lá nhỏ. YE (g/L) Thời điểm bổ sung (ngày nuôi cấy) Hàm lượng oleanolic acid (mg/g khô) Hàm lượng oleanolic acid (mg/bình) Tăng so với đối chứng (lần) ĐC 25,40d 9,86d 1,00 0 37,34d 9,60d 1,47 1 3 95,00 b 28,31b 3,74 6 164,34a 78,55a 6,47 9 84,84b 39,36b 3,34 0 34,29d 7,48d 1,35 2 3 66,55 c 18,43c 2,62 6 98,81b 43,18b 3,89 9 61,21c 28,65c 2,41 0 27,69d 5,51d 1,09 3 3 42,42 d 11,28d 1,67 6 64,77c 25,26c 2,55 9 42,93d 19,79d 1,69
ĐC: đối chứng không bổ sung elicitor
Thời điểm xử lý elicitor khác nhau, hiệu quả thu được cũng khác nhau, trong đó tốt nhất là bổ sung sau 6 ngày nuôi cấy, việc bổ sung YE vào thời điểm 3 ngày hay 9 ngày cho hiệu quả tương đương ở tất cả các nồng độ được khảo sát, và cao hơn thời điểm bổ sung ban đầu. Trong quá trình sinh trưởng của tế bào đinh lăng lá nhỏ, 6 ngày là thời điểm tế bào đạt 1/3 thời gian sinh
trưởng (Hình 3.6), tế bào kết thúc pha lag và bắt đầu vào pha sinh trưởng (pha log), nên thuận lợi cho việc bắt đầu tích lũy hợp chất thứ cấp trong tế bào.
Hình 3.9. Dịch huyền phù tế bào (A), sinh khối tươi (B) và sinh khối khô (C) của tế bào đinh lăng lá nhỏ trong môi trường cơ bản MS có 20 g/L sucrose; 1 mg/L BAP; 0,5 mg/L 2,4-D bổ sung YE 3 g/L lúc bắt đầu nuôi cấy.
Hình 3.10. Dịch huyền phù tế bào (A), sinh khối tươi (B) và sinh khối khô (C) của tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ trong môi trường cơ bản MS có 20 g/L sucrose; 1 mg/L BAP; 0,5 mg/L 2,4-D bổ sung YE 1 g/L sau 6 ngày nuôi cấy.