5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN
2.2.5.Định lượng oleanolic acid
2.2.5.1. Tách chiết oleanolic acid
Mẫu (mẫu tự nhiên, tế bào huyền phù) sau khi xác định khối lượng tươi được sấy khô ở 50oC đến khối lượng không đổi, sau đó cân để xác định khối lượng khô [86]. Mẫu khô sau đó được nghiền mịn và chiết với methanol (Merck, Đức) theo tỷ lệ 1 g bột mẫu: 5 mL methanol. Hỗn hợp chiết được trộn đều và ủ ở 37oC trong 10 phút. Hỗn hợp được phân làm hai lớp sau khi ủ, hút cẩn thận lấy dịch nổi phía trên, lặp lại 3 lần để thu dịch chiết tế bào. Mẫu chiết được đem sấy ở 50oC qua đêm đến khi methanol bay hơi hết. Tiếp theo bổ sung methanol với thể tích tương đương ban đầu để tái hòa tan oleanolic acid. Dịch chiết oleanolic acid của tế bào thân đinh lăng lá nhỏ được lọc qua màng lọc 0,45 µm, bảo quản ở 4oC để sử dụng cho phân tích HPLC sau này.
2.2.5.2. Phân tích HPLC
Hàm lượng oleanolic acid được xác định bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) theo Kochkin và cs (2014) [56].
và 0,1% acetic acid, với cột C18 (InertSustain C18 5 µm, 4,6×250 mm), nhiệt độ cột 24oC, tốc độ dòng 1 mL/phút, thể tích tiếp mẫu 5 µL. Oleanolic acid được phát hiện ở bước sóng 210 nm. Phân tích HPLC được tiến hành trên hệ thống sắc kí HPLC Shimadzu LC20A (Shimadzu, Nhật Bản).
Tất cả dung môi đạt tiêu chuẩn phân tích HPLC được mua từ hãng Merck (Đức). Oleanolic acid của hãng Sigma được dùng làm chất chuẩn để xác định hàm lượng oleanolic acid (Bảng 2.1). Hàm lượng oleanolic acid được xác định dựa theo đường chuẩn xây dựng từ diện tích đỉnh (peak) của các nồng độ oleanolic acid chuẩn khác nhau trong phân tích HPLC.
Phương trình đường chuẩn là: y = 3456x + 588,42 (R2 = 0,9966), trong đó: y là hàm lượng oleanolic acid (µg/mL), x là diện tích đỉnh.
Hàm lượng oleanolic acid trong sinh khối khô được tính theo công thức: C (mg/g) = y.V/(m.1000), trong đó: V là thể tích mẫu chiết (mL), m là khối lượng mẫu để chiết (g), 1000 là đơn vị quy đổi từ mg sang µg.