5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN
3.2.3.Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng
Môi trường cơ bản MS chứa 20 g/L sucrose đã được sử dụng để nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy tế bào đinh lăng lá nhỏ, kết quả trình bày ở bảng 3.7.
Số liệu trình bày ở bảng 3.7 cho thấy, 1 mg/L BAP kết hợp với 0,5 mg/L 2,4-D hoặc 1,25 mg/L KIN kết hợp với 1 mg/L 2,4-D đã kích thích sự sinh trưởng của tế bào, sinh khối khô đạt tương ứng là 0,45 g và 0,40 g/bình, cao hơn so với đối chứng (1 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L KIN). Ở công thức kết hợp 1 mg/L BAP và 1 mg/L 2,4-D, sự tích lũy sinh khối khá tốt (6,71 g/bình) tuy nhiên sinh khối khô không cao hơn các công thức khác (0,38 g/bình). Ở các công thức khác, sự sinh trưởng của tế bào kém hơn, tuy nhiên sự khác biệt giữa chúng là không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Nhìn chung, sự kết hợp giữa BAP và 2,4-D hiệu quả hơn KIN và 2,4-D,
Giữa 3 công thức trên, 2 công thức môi trường bao gồm cơ bản MS có bổ sung 1 mg/L BAP kết hợp với 0,5 mg/L 2,4-D hoặc 1,25 mg/L KIN kết hợp với 1 mg/L 2,4-D được lựa chọn để đánh giá hàm lượng oleanolic trong tế bào do 2 công thức này có sự tích lũy sinh khối khô cao nhất trong 2 nhóm phối hợp chất điều hòa sinh trưởng. Sự tích lũy sinh khối khô là chỉ tiêu quan trọng trong sự sinh trưởng của tế bào, có thể ảnh hưởng trực tiếp đến sự tích lũy các hợp chất thứ cấp.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của KIN và BAP kết hợp với 2,4-D lên khả năng sinh trưởng của tế bào
Chất điều hòa sinh trưởng (mg/L) Khối lượng tươi (g/bình) Khối lượng khô (g/bình) KIN BAP 2,4-D 0,50 - 0,5 5,37bc 0,26cd 0,75 - 0,5 5,53b 0,25cd 1,00 - 0,5 5,76b 0,29c 1,25 - 0,5 6,48a 0,33bc 1,50 - 0,5 5,14c 0,25cd - 0,50 0,5 5,23bc 0,37b - 0,75 0,5 5,50b 0,37b - 1,00 0,5 6,61a 0,45a - 1,25 0,5 6,39a 0,38b - 1,50 0,5 5,22bc 0,30c 0,50 - 1,0 5,39bc 0,31c 0,75 - 1,0 5,20bc 0,30c 1,00 - 1,0 5,32bc 0,31c 1,25 - 1,0 5,60b 0,40b 1,50 - 1,0 5,20c 0,25cd - 0,50 1,0 5,22bc 0,33bc - 0,75 1,0 5,34bc 0,36b - 1,00 1,0 6,71a 0,38b - 1,25 1,0 5,74b 0,33bc - 1,50 1,0 5,54b 0,32bc
Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ ra sự sai khác có mức ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p<0,05 (Duncan’s test).
3.2.4. Sự tích lũy oleanolic acid trong tế bào
Phân tích HPLC cho thấy, sắc ký đồ của chất chuẩn và dịch chiết xuất hiện các đỉnh cùng thời gian lưu (khoảng 3,6 phút). Kết quả này đã chứng
minh rằng, oleanolic acid có mặt trong tất cả các mẫu được thử nghiệm, bao gồm lá của cây in vitro và các tế bào được nuôi cấy ở 2 môi trường khác nhau. Các tế bào được nuôi cấy trong môi trường cơ bản MS được bổ sung 1 mg/L BAP + 0,5 mg/L 2,4-D và 1,25 mg/L KIN + 1 mg/L 2,4-D tích lũy lượng oleanolic acid lần lượt là 25,4 mg/g và 24,9 mg/g khô. Trong khi đó, hàm lượng chất này trong lá là 10,7 mg/g khô (Hình 3.8 và Bảng 3.8), thấp hơn khoảng 2,4 lần so với tế bào nuôi cấy in vitro. Kết quả này cho thấy, tiềm năng sản xuất oleanolic acid, một hợp chất có giá trị dược lý cao, từ nuôi cấy tế bào đinh lăng lá nhỏ.
Từ kết quả thể hiện ở bảng 3.8, môi trường có bản MS có bổ sung 1 mg/L BAP + 0,5 mg/L 2,4-D được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo do môi trường này có sự tích lũy sinh khối cao hơn trong khi lượng chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng ít hơn.
Bảng 3.8. Hàm lượng oleanolic acid trong các loại mẫu khác nhau.
Mẫu Thời gian lưu (phút) Diện tích đỉnh (mAU×s) Hàm lượng (mg/g khô) Lá 3,559 2.488.855 10,7 Tế bào (1) 3,563 5.807.463 24,9 Tế bào (2) 3,568 5.910.347 25,4 Mẫu chuẩn 3,563 2.323.524 1 mg/mL
Tế bào (1): Tế bào sinh trưởng trên môi trường bổ sung 1,25 mg/L KIN và 1 mg/L 2,4-D. Tế bào (2): Tế bào sinh trưởng trên môi trường bổ sung 1 mg/L BAP và 0,5 mg/L 2,4-D. KL: khối lượng.
Hình 3.8. Sắc ký đồ HPLC phân tích hàm lượng oleanolic acid. A. Chất chuẩn oleanolic acid, B. Mẫu lá, C. Tế bào trên môi trường cơ bản MS chứa 1 mg/L BAP và 0,5 mg/L 2,4-D, D. Tế bào trên môi trường cơ bản MS chứa 1,25 mg/L KIN và 1 mg/L 2,4-D.