5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN
1.3.5. Các nghiên cứu sản xuất oleanolic acid bằng nuôi cấy mô và tế bào thực
thực vật
1.3.5.1. Sản xuất oleanolic acid từ nuôi cấy callus
Oleanolic acid có thể được tổng hợp từ nhiều loài cây khác nhau, vì vậy, nuôi cấy callus từ nhiều loài cây khác nhau để thu nhận oleanolic acid cũng đã được quan tâm nghiên cứu. Khả năng tổng hợp oleanolic acid và ursolic acid từ nuôi cấy callus loài Salvia tomentosa Mill đã được Georgiev và cs (2014) thông báo. Các dòng callus thu được cho thấy sự thay đổi lớn trong tiềm năng sinh tổng hợp của chúng. Nguyên nhân là do sự đa bội thể của tế bào thực vật trong các mô callus được tác động bởi các chất điều hòa sinh trưởng sử dụng trong cảm ứng tạo callus. Một dòng bát bội thể (octaploid) bao gồm các tế bào 8C, 16C và 32C được lựa chọn làm nguồn sản xuất oleanolic acid và ursolic acid với hàm lượng thu được tương ứng là 991,57 μg/g khối lượng khô và 641,85 μg/g khối lượng khô [41].
Nuôi cấy callus có xử lý elicitor để thu nhận oleanolic acid cũng đã được nhiều tác giả nghiên cứu và công bố. Zhao và cs (2013) tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các elicitor đến khả năng tích lũy oleanolic acid và sự biểu hiện của các gen tổng hợp triterpenoid trong nuôi cấy callus loài Gentiana straminea. Kết quả nghiên cứu cho thấy, nhiệt độ thấp có ảnh hưởng đến sự
tích lũy oleanolic acid và cả hai yếu tố nhiệt độ thấp và bức xạ UV-B làm thay đổi biểu hiện của các gen tổng hợp triterpenoid. Tuy nhiên, sử dụng MeJA đã tăng cường đáng kể lượng oleanolic acid tích lũy và điều hòa gen tổng hợp triterpenoid, đặc biệt lá sự biểu hiện của βAS, gen mã hóa β-amyrin [127]. Ảnh hưởng của MeJA và SA đến khả năng sản xuất oleanolic acid và ursolic trong nuôi cấy callus Lepechinia caulescens đã được Martínez và cs (2017) nghiên cứu. Môi trường nuôi cấy có bổ sung 3,0 mg/L 2,4-D và 0,1 mg/L BAP cảm ứng tạo callus và sản xuất ursolic acid và oleanolic acid mạnh nhất với hàm lượng tương ứng là 1,57 mg/g và 1,13 mg/g khối lượng khô. Các elicitor được bổ sung trong quá trình nuôi cấy làm thay đổi khả năng tích lũy oleanolic và ursolic acid; trong đó, MeJA 50 μM cho kết quả tốt nhất với hàm lượng ursolic acid tăng gấp 5,6 lần và oleanolic acid tăng gấp 4,7 lần so với đối chứng sau 8 giờ xử lý elicitor [75].
1.3.5.2. Sản xuất oleanolic acid từ nuôi cấy huyền phù tế bào
Đến nay, nhiều đối tượng thực vật đã được nuôi cấy tế bào để sản xuất oleanolic acid. Haas và cs (2014) thiết lập được hệ thống sản xuất oleanolic acid và ursolic acid bằng nuôi cấy huyền phù tế bào các loài Salvia spp. Mười một dòng callus từ các loài Salvia officinalis, S. virgata và S. fruticosa đã được chọn lọc để xây dựng hệ thống nuôi cấy huyền phù. Sau quá trình nuôi cấy được thực hiện thành công và được tiến hành trong hệ thống giám sát hoạt động hô hấp (RAMOS®) để thu thập dữ liệu trực tiếp về động học sinh trưởng của chúng và thiết lập lịch trình thu mẫu thích hợp để xác định thời điểm sản xuất oleanolic acid và ursolic acid. Dựa trên đường cong sinh trưởng, thành phần oleanolic acid và ursolic acid và các đặc tính tổng hợp, một hệ thống nuôi cấy huyền phù từ mỗi loài Salvia nghiên cứu đã được chọn để tối ưu hóa thêm. Giá trị µmax trong các hệ thống nuôi cấy này dao động từ 0,20 đến 0,37/ngày, hàm lượng oleanolic acid và ursolic acid của chúng lớn hơn 1,3 và 1,2 mg/g tương ứng và chúng tạo ra hiệu suất tối đa là 21 mg/L cho oleanolic
acid và 32,8 mg/L cho ursolic acid [42]. Cyclocarya paliurus là một loài thực vật chỉ có ở miền trung Trung Quốc với các tác dụng hạ đường huyết và giảm mỡ máu. Để sử dụng tốt hơn nguồn tài nguyên thực phẩm chức năng này, nuôi cấy tế bào C. paliurus và tích lũy triterpenic acid đã được Yin và cs (2013) nghiên cứu. Huyền phù tế bào đồng nhất và ổn định thu được trên môi trường cơ bản MS có bổ sung 0,5 mg/L 2,4-D, 0,3 mg/L NAA và cytokinin. Hàm lượng triterpenic acid tổng số, ursolic và oleanolic acid trong các tế bào nuôi cấy huyền phù cao hơn đáng kể so với trong lá và callus, với mức tăng lên đến 6,24, 2,28 và 0,94% (khối lượng khô). Hàm lượng betulinic acid của tế bào nuôi cấy huyền phù cũng đạt 0,82%, cao hơn đáng kể so với trong nuôi cấy callus. Những kết quả này cho thấy, rằng nuôi cấy huyền phù tế bào C. paliurus cho hàm lượng triterpenic acid tích lũy cao và có thể được sử dụng để sản xuất triterpenic, ursolic, oleanolic và betulinic acid [125].
Để cải thiện khả năng sinh tổng hợp oleanolic trong nuôi cấy tế bào, nhiều nghiên cứu đã sử dụng elicitor để kích hoạt quá trình chuyển hóa thứ cấp ở thực vật. Kumar và cs (2015) khảo sát ảnh hưởng của các elicitor khác nhau đến khả năng sản xuất oleanolic, ursolic và betulinic acid trong nuôi cấy huyền phù loài L. camara. Xử lý bằng nấm Piriformospora indica với nồng độ 2,5% (v/v) cho kết quả sản xuất các hợp chất triterpenoid ở mức cao nhất, nồng độ ursolic acid tăng gấp 3,5 lần (3869,3 µg/g khối lượng khô), oleanolic acid gấp 5,6 lần (1425,7 µg/g khối lượng khô) và betulinic acid gấp 7,8 lần (117,02 µg/g khối lượng khô) [58]. Arican (2016) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các loại elicitor sinh học đến khả năng tổng hợp triterpene trong nuôi cấy tế bào Alstonia scholaris. Quá trình nuôi cấy được xử lý với các loại nấm
Candida albicans, F. oxysporum, Penicillium avelanium và Saccharomyces cerevisiae. Các elicitor này đã gây ra sự kích thích nhanh chóng quá trình trao đổi chất thứ cấp của các tế bào A. scholaris dẫn đến tăng sinh tổng hợp triterpenoid. Khi tiếp xúc trong thời gian dài, một số dòng tế bào có khả năng
tăng gấp đôi sản lượng của triterpenes. S. cerevisiae là elicitor tốt nhất với hàm lượng ursolic acid và oleanolic acid tích lũy tương ứng đạt 5 và 7 mg/g khối lượng khô [25]. Nuôi cấy huyền phù tế bào Kalopanax septemlobus đã được Lee và cs (2018) thực hiện nhằm phát triển một hệ thống sản xuất bền vững và ổn định các hợp chất saponin. Lượng saponin tối đa (1,56 mg/60 mL) tích lũy được sau 15 ngày nuôi cấy. Khi bổ sung coronatine 1 μM vào quá trình nuôi cấy, lượng saponin tích lũy tăng lên 160% so với đối chứng. Ngoài ra, các tác giả nhận thấy, coronatine làm tăng biểu hiện enzyme β-amyrin synthase từ đó dẫn đến tăng tích lũy oleanolic acid với hàm lượng 2,37 µg/mg chiết xuất [89].
1.3.5.3. Sản xuất oleanolic acid từ nuôi cấy rễ tơ
Hệ thống nuôi cấy rễ tơ (hairy root) hiện nay đã trở nên phổ biến và được sử dụng như một phương thức có nhiều tiềm năng để sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp. Rễ tơ là các rễ đột biến trong quá trình nuôi cấy biệt hóa, được tạo ra bởi sự lây nhiễm A. rhizogenes vào các loài thực vật bậc cao tại các vị trí bị tổn thương. Tác nhân gây bệnh này gây ra sự phát triển các khối u của rễ được đặc trưng bởi tốc độ sinh trưởng cao trong môi trường không chứa hormone và có sự ổn định di truyền khi nuôi cấy trong một thời gian dài. Rễ tơ có con đường tổng hợp các hợp chất cũng giống với ở các cơ quan tự nhiên nhưng lại cho năng suất cao hơn nhiều lần [90], [94]. Dlugosz và cs (2013) đã tiến hành sản xuất oleanolic acid bằng nuôi cấy rễ tơ loài Calendula officinalis. Lá mầm hay trụ dưới lá mầm thu từ cây in vitro được gây nhiễm với chủng A. rhizogenes ATCC 15834 (đối chứng) hoặc cùng chủng có chứa vector pCAMBIA 1381Z mang gene mã hóa β-glucuronidase dưới sự kiểm soát của promoter của gen NIK cà chua (nematode induced kinase). Hiệu quả của quá trình cảm ứng rễ tơ đạt 33,8% đối với lá mầm và 66,6% đối với trụ dưới lá mầm trong cả hai thí nghiệm chuyển đổi. Cuối cùng, 8 dòng đối chứng và 9 dòng biến đổi đã được thiết lập cho quá trình nuôi cấy lâu dài. Kết
quả phân tích cho thấy, thành phần chính của glycoside được tổng hợp là oleanolic acid (97%). Các dòng đối chứng tổng hợp oleanolic acid với lượng trung bình là 8,42 mg/g khối lượng khô trong mô và 0,23 mg/dm3 môi trường; dòng biến đổi chứa 4,59 mg/g trong mô và 0,48 mg/dm3 môi trường. Ngoài ra, các dòng rễ tơ nuôi cấy cho thấy lượng sinh khối tích lũy và nồng độ oleanolic acid trong mô tỉ lệ thuận với nhau [35]. Markowski và cs (2018) đã nghiên cứu tăng cường tổng hợp một loại saponin là oleanan mới bằng nuôi cấy rễ tơ loài cúc vạn thọ bản địa C. officinalis có sử dụng elicitor. Rễ tơ được cảm ứng bằng cách đồng nuôi cấy lá mầm với chủng A. rhizogenes 15834. Kết quả nghiên cứu cho thấy, bổ sung JA 100 μM trong quá trình nuôi cấy giúp tăng gấp 10 lần một hợp chất saponin bisdesmoside mới có công thức là 3-O-β-D-glucuronopyranosyl-28-O-β-D-galactopyranosyl-oleanolic acid mà không được tìm thấy trong cây C. officinalis tự nhiên. Đây là một phân tử glucuronide, trong khi glucuronide của thực vật bản địa chủ yếu được tích lũy trong hoa còn glucoside là saponin được tìm thấy nhất trong rễ. Vì vậy, các tác giả nhận định các con đường sinh tổng hợp saponin, đặc biệt là phản ứng của glycosyl hóa, có thể được thay đổi trong nuôi cấy rễ tơ C. officinalis [74].
Silene vulgaris là một loài thực vật được phân bố rộng rãi ở Bắc Mỹ và chứa các saponin loại oleanane có hoạt tính sinh học. Khả năng sản xuất saponin bằng nuôi cấy rễ tơ loài này đã được Kim và cs (2015) nghiên cứu thành công. Rễ tơ của loài S. vulgaris được hình thành bằng cách lây nhiễm các mẫu lá với năm chủng A. rhizogenes (LBA9402, R1000, A4, 13333 và 15834). Các chủng A. rhizogenes LBA9402 gây nhiễm với tỉ lệ 100% và tạo ra nhiều rễ tơ nhất trên mỗi mẫu nuôi cấy. Khi bổ sung MeJA trong quá trình nuôi cấy, khả năng tích lũy saponin triterpenoid trong rễ tơ S. vulgaris có sự thay đổi. Lượng segetalic và gypsogenic acid sau khi xử lý với MeJA cao gấp 5 và 2 lần tương ứng so với đối chứng. Do đó, nuôi cấy rễ tơ của S. vulgaris
Tác động của nguồn nitơ lên sự sinh trưởng tế bào, tích lũy và tiết saponin trong nuôi cấy rễ tơ và nuôi cấy huyền phù loài C. officinalis đã được Długosz và cs (2018) nghiên cứu. Rễ tơ sử dụng nitrate như là một nguồn khoáng nitơ, nhưng tác động của nó lên sự sinh trưởng, tích lũy oleanolic acid, và bài tiết ra môi trường còn phụ thuộc vào các dòng tế bào nuôi cấy. Năng suất cao nhất của oleanolic acid thu được từ dòng CC16 (74,86 mg/bình) trong môi trường MS thay đổi với KNO3 tăng 2,5 lần và thay amonium bằng 2,5 g/L peptone. Nguồn nitơ hữu cơ ở mức 27,5 g/L làm giảm tốc độ sinh trưởng của rễ tơ. Tác dụng của nó đối với sự tích lũy và tiết saponin ra môi trường xung quanh phụ thuộc vào các dòng và thành phần môi trường nuôi cấy. Tỉ lệ nitrate: ammonium là 4: 2 trong nuôi cấy dòng CC16 dẫn đến việc tăng hàm lượng saponin 5,7 lần so với môi trường chuẩn. Hàm lượng oleanolic acid cao nhất (171,97 μg/g khối lượng khô) được ghi nhận trong môi trường nuôi cấy có nguồn nitrate là dạng khoáng chất duy nhất của nitơ. Peptone từ lactalbumin có tác dụng ức chế sự hình thành saponin; tuy nhiên, nó là điều cần thiết cho sự khởi đầu nuôi cấy, tăng sinh và biệt hóa cơ quan [36].
Nhìn chung, đã có nhiều nghiên cứu sản xuất hợp chất này từ nuôi cấy in vitro thực vật, đây là hướng nghiên cứu nhiều tiềm năng khi được áp dụng trên các đối tượng nghiên cứu khác nhau, trong đó có cây đinh lăng.