HỆ THỐNG HPLC
2.2.1.1. Sơ đồ thiết bị
Sơ đồ 2.2.1.1: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC
Trong đó :
(1) : Hệ thống dung môi (pha động). (2) : Hệ thống Gradient.
(3) : Bơm cao áp (pump).
(4) : Bộ phận tiêm mẫu (injector). (5) : Cột tách (column).
(6) : Đầu dò (detector).
(7) : Hệ thống ghi nhận và xử lý tín hiệu.
2.2.1.2. Chức năng từng bộ phận
− Hệ thống dung môi
Hiện tại máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp. Cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng 1 lần để rửa giải theo tỷ lệ mong muốn và tổng tỷ lệ dung môi của 4 đường là 100 %.
49
Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì chúng ta ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc mà chúng ta chi sử dụng tối đa là 3 và 2 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn để quá trình rửa giải ổn định .
Hiện 4 đường dung môi phục vụ chủ yếu cho việc rửa giải Gradient dung môi theo thời gian và công tác xây dựng tiêu chuẩn .
Hình 2.2.1.2.1: Bình chứa dung môi pha động
Lưu ý :
+ Tất cả các dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết và có ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC Hay dung môi tinh khiết phân tích.
+ Tất cả các hóa chất dùng để pha mẫu và pha hệ đệm phải được sử dụng là hóa chất tinh khiếtphân tích.
Nhằm mục đích tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo ra các Peak tạp trong quá trình phân tích.
− Hệ thống gradient
Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động.
Nếu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót các bọt khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ sảy ra.
+ Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian lưu của Peak thay đổi.
50
+ Trong trường hợp bọt quá nhiều Bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì có thể Bơm sẽ không hút được dung môi (bị e) khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động.
Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai.
− Bơm cao áp
Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký. Bơm phải tạo được áp suất cao khoảng 3000-6000 PSI hoặc 250-500 at (1at =0.98 Bar) và bơm phải tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 9.999 ml/phút (hiện nay đã có nhiều loại bơm có áp suất rất cao lên đến 1200 bar)
Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường có áp suất tối đa 412 Bar. Tốc độ dòng 0.1-9.999 ml/phút .
Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt. Hiện tại bơm có 2 Pistone để thay phiên nhau đẩy dung môi liên tục . (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 2.2.1.2.2: Hệ thống bơm cao áp
− Bộ phận tiêm mẫu
Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy. Với dung tích của lớp là 5 - 100l .
Có 2 cách lấy mẫu vào trong cột : Bằng tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng tay) và tiêm mẫu tự động (Autosample).
51
Hình 2.2.1.2.3: Bộ phận tiêm mẫu bằng tay
Hình 2.2.1.2.4: Hệ thống tiêm mẫu tự động
− Cột tách
Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao. Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10- 30cm, đường kính trong 1-10mm, hạt chất nhồi cỡ = 5-10 m. (Ngoài ra còn có một số trường hợp đặc biệt về kích thước và kích cỡ hạt....).
Với chất nhồi cột cỡ = 1.8-5 m có thể dùng cột ngắn (3-10 cm) và nhỏ (đường kính trong 1-4.6 mm) loại cột này có hiệu năng tách cao.
Chất nhồi cột tùy theo loại cột và kiểu sắc ký (trong các dược điển USP 23, 24 có tiêu chuẩn hóa các loại cột).
52
Thông thường chất nhồi cột là Silicagel (pha thuận) hoặc là Silicagel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo), ngoài ra người ta còn dùng các loại hạt khác như: Nhôm Oxit, Polyme xốp, chất trao đổi ion.
Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong bộ phận điều nhiệt (Oven column).
Hình 2.2.1.2.5: Cột tách
− Đầu dò
Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên săc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại Detector thích hợp và phải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích.
A = k.C Trong đó: A: là tín hiệu đo được
C: nồng độ chất phân tích
k: là hằng số thực nghiệm của Detector đã chọn
Tín hiệu này có thể là : độ hấp thụ quang (UV-VIS), Cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất …
53
Trên cơ sở đó người ta chế tạo các loại Detector sau :
+ Detector quang phổ tử ngoại 200 - 380 nm để phát hiện UV.
+ Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS): 190 - 900 nm để phát hiện các chất hấp thụ quang. Đây là loại thông dụng nhất.
+ Detector huỳnh quang để phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên cũng như các dẫn chất có huỳnh quang. Là loại Detector có độ chọn lọc cao nhất .
+ Loại hiện đại hơn có Detector Diod Array, ELSD (Detector tán xạ bay hơi) các Detector này có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thu cực đại của các chất.
Ngoài ra còn có một số loại Detector khác là:
+ Detector điện hóa: Đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng ...
+ Detector Chiết suất vi sai: Detector khúc xạ (thông thường dùng cho đo các chất đường). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Detector đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt …
54
− Hệ thống ghi nhận và xử lý tín hiệu
Để ghi tín hiệu phát hiện do Detector truyền sang.
+ Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích của Peak, chiều cao …
+ Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thể lưu tất cả các thông số, phổ đồ và các thông số của Peak như tính đối xứng, hệ số phân giải ... trong quá trình phân tích đồng thời sử lý, tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử dụng như: Nồng độ, RSD, ...
Sau khi đã phân tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính toán ra giấy để hoàn thiện hồ sơ.
55
2.2.2. NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG
- Hệ thống dung môi (1) đóng vai trò pha động được trộn với nhau theo tỉ lệ thích hợp (điều khiển bằng máy tính) và có thể thay đổi thành phần bởi hệ thống Gradient (2). - Pha động được bơm liên tục qua cột tách bằng hệ thống bơm cao áp (3).
- Mẫu phân tích được đưa vào cột tách bằng bộ phân tiêm mẫu (4), sau đó được pha động đẩy vào cột tách (5), quá trình tách xảy ra ở đây.
- Các chất sau khi ra khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau lần lượt vào detector (6) thích hợp và được chuyển thành thế hiệu điện rồi được khuyếch đại và chuyển đến bộ phận tự ghi. Và xử lý kết quả (7).