− Vai trò của pha động: sử dụng dung môi có vai trò pha động để rửa giải các chất
phân tích ra khỏi cột tách.
− Lựa chọn pha động:
Dựa vào các tài liệu, Dược điển, thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích ...ta lựa chọn pha động phù hợp để cho quá trình rửa giải tách hoàn toàn các chất có trong mẫu đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn của peak đã trình bày đồng thời phải có thời gian phân tích phù hợp nhằm tiết kiệm được dung môi, hóa chất, thời gian phân tích mẫu, giảm thiểu sự hoạt động của thiết bị.
Pha động có thể làm thay đổi : - Độ chọn lọc
62 - Thời gian lưu
- Hiệu năng tách của cột - Độ phân giải
- Tính đối xứng của Peak
Do đó, trong một pha tĩnh đã chọn nếu ta chọn được pha động có thành phần phù hợp thì ta sẽ có hiệu suất tách sắc ký tốt nhất đối với hỗn hợp các chất cần phân tích. Chính vì vậy pha động cần có các yêu cầu sau:
- Pha động phải trơ với pha tĩnh đã có. Không được làm cho pha tĩnh bị biến đổi hóa học. (Vd giá trị pH : 2.5< pH <8.5)
- Pha động phải hòa tan được các chất phân tích thì mới rửa giải được chúng. Đặc biệt phải chú ý khi thay đổi pha động phải rửa cột bằng dung môi phù hợp để không làm tủa các chất có trong cột, hay pha động có sẵn trong cột. Ví dụ: đệm phosphat rửa ngay bằng acetonitril hay methanol sẽ bị kết tủa trên column.
- Pha động phải bền vững theo thời gian: càng bền lâu càng tốt nhưng ít nhất là chúng là pha động không bị phân hủy trong suốt thời gia phân tích mẫu. - Phải có độ tinh khiết cao : dung môi cho HPLC, hoá chất tinh khiết phân
tích.
- Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký
- Phải phù hợp với loại Detector. Ví dụ: UV - VIS thì dung môi không được hấp thụ quang (Ví dụ: acid acetic ở bước sáng thấp < 220 nm). Detector huỳnh quang thì dung môi không được phát quang.
- Phải kinh tế, không quá hiếm và đắt.
− Các loại dung môi được sử dụng làm pha động trong HPLC
- Dung môi đơn : methanol, axetonitril, benzen, n-hexan, H2O - Hỗn hợp dung môi trộn theo tỉ lệ thích hợp :
63 Methanol : H2O = 70 : 30
Axetonitril : H2O = 80 : 20
- Dung môi nước có chứa các chất đệm pH, chất tạo phức, chất làm chậm (thường dùng trong HPLC trao đổi ion).
2.2.5.2. Pha tĩnh trong HPLC
− Vai trò của pha tĩnh: Dùng để tách các chất không phân cực, ít phân cực, các
chất phân cực có thể tạo cặp Ion.
− Các yêu cầu của pha tĩnh sử dụng trong HPLC
- Trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký
- Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan trong điều kiện sắc ký nhất định.
- Tính chất bề mặt phải ổn định. - Có độ tinh khiết cao.
- Nhanh đạt các cân bằng động học. - Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất.
− Các nguyên liêu sử dụng làm pha tĩnh :
- Pha tĩnh trên nền sillicagel. - Pha tĩnh trên nền nhôm oxit.
- Pha tĩnh trên nền hợp chất cao phân tử. - Pha tĩnh trên nền mạch Cacbon.
Silicagel được sử dụng nhiều nhất vì có nhiều ưu điểm, khả năng chịu áp suất cao, độ trương nở nhỏ khi thay đổi dung môi, bền nhiệt.
64