PHƯƠNG PHÁP TRÍCH LY BẰNG VI SÓNG

2.7.1. NGUYÊN TẮC

Vi sóng theo thuật ngữ tiếng Anh "microwave" là các sóng cực ngắn hay còn gọi là sóng vi ba có bước sóng từ 1 mm đến 1m. Năng lượng của vi sóng là năng lượng điện từ. Tần số của vi sóng thường được sử dụng trong công nghiệp, y tế và khoa học là 915 MHz, 2450 MHz, 5800 MHz, và 22125 MHz. Tần số 2450 MHz (tương đương bước sóng 12,2 cm) được sử dụng nhiều nhất trong các thiết bị dân dụng và các thiết bị chuẩn bị mẫu cho phân tích.

Năng lượng vi sóng được phát ra từ một nguồn phát sóng điện từ. Bản chất của vi sóng là sóng điện từ gồm hai yếu tố : yếu tố từ trường B và yếu tố điện trường E. Quá trình chuyển hoá năng lượng điện từ thành năng lượng nhiệt bao gồm hai cơ chế

− Cơ chế chuyển dẫn ion. − Cơ chế quay cực phân tử.

Sự đốt nóng bằng kỹ thuật vi sóng dựa trên sự hấp thụ trực tiếp năng lượng vi sóng của mẫu, do vậy các hiện tượng như dẫn nhiệt, đối lưu nhiệt và bức xạ nhiệt chỉ đóng vai trò thứ yếu trong quá trình cân bằng nhiệt.

Sóng siêu âm gây ra sự phá vỡ cấu trúc vật lý một cách mãnh liệt gây ra sự khuếch tán vào trong dung môi của các axit cần chiết xuất. Còn với phương pháp dùng dung môi thì gây ra sự khuếch tán chậm các axit. Qua cơ chế này, ta thấy phương pháp dùng sóng siêu âm hỗ trợ thì hiệu quả hơn và nhanh hơn.

Mặt khác theo phân tích HPLC/MS chỉ rõ rằng không có sự khác biệt có ý nghĩa về thành phần các axit giữa 2 phương pháp. Vì thế, tiến trình chiết xuất có hỗ trợ của sóng siêu âm không dẫn đến sự phá hủy cấu trúc cũng như làm thây đổi tính chất của axit. Do đó, sự lựa chọn phương pháp chiết xuất có hỗ trợ của sóng siêu âm là tốt nhất do năng lượng nhỏ và thời gian chiết xuất ngắn hơn.

Sóng siêu âm có tần số lớn hơn 20 Khz tức là hơn 20000 dao động trong một giây xung động truyền qua môi trường vật chất (khí, lỏng, rắn) vào tận trong tế bào dược liệu , đồng thời nó còn làm tăng nhiệt độ. Những tác động đó làm tăng vận tốc hòa tan,

95

khuếch tán hoạt chất vào dung môi, vì vậy rút ngắn thời gian chiết. Măt khác, nó còn làm giảm sự tiêu hao năng lượng.

Hình 2.7.1.1: Thiết bị rữa bằng vi sóng

2.7.2. ƯU ĐIỂM VÀ NHƯỢC ĐIỂM 2.7.2.1. Ưu điểm 2.7.2.1. Ưu điểm

− Thời gian chiết nhanh

− Hiệu suất chiết cao hơn so với một số phương pháp chiết thông thường. − Sản phẩm trích ly chất lượng tốt.

− Thiết bị dễ sử dụng, an toàn và bảo vệ môi trường.

2.7.2.2. Nhược điểm

− Chỉ có thể áp dụng với qui mô nhỏ.

− Phản ứng cần thực hiện trong một hệ kín và chỉ sử dụng một lượng nhỏ tác chất.

96

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM

3.1. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT BÉO TRONG DA TỰ NHIÊN NHIÊN

Có rất nhiều phương pháp để phân tích axit béo trong da ngoài phương pháp phân tích bằng GC-MS và HPLC người ta còn sử dụng phương pháp chuẩn độ axit – bazo để xác định axit béo trong da, đây là một phương pháp đơn giản để xác định axit béo trong da. Sau đây là quy trình xác định axit béo trong da bằng phương pháp chuẩn độ axit – bazo.

3.1.1. MỤC ĐÍCH

Trong các sản phẩm bằng da tự nhiên khi sử dụng một thời gian thì các sản phẩm có mùi hôi khó chịu. Nguyên nhân là do sự oxi hóa do enzym lipo-oxydaza (có thể có sẵn trong chất béo hay do vi sinh vật xâm nhập tạo ra) hoặc oxi hóa xeton (với chất béo có axit béo no, phân tử lượng nhỏ hay trung bình) tích tụ ankil-metyl-xeton có mùi khó chịu. Cơ chế phản ứng này rất phức tạp.

Axit béo tự do cũng làm ảnh hưởng đến những mẫu da dùng để xây dựng đường chuẩn để phân tích các hợp chất khác. Làm sai lệch đường chuẩn ảnh hưởng đến kết quả đo các hợp chất đó.

3.1.2. QUY TRÌNH TIẾN HÀNH

Cân 2g da cắt nhỏ (24mm) hoặc cắt mịn cho vào trong vial 20ml, sau đó thêm 10ml dichloromethane đậy kín vial và siêu âm ở 50oC trong 3h. Lọc dung môi chiết và để cho dichloromethane bay hơi tự nhiên trong tủ hút. Khi dichloromethan bay hơi hết sẽ còn lại phần cặn không bay hơi ta hòa tan chúng bằng cách thêm 10ml hỗn hợp diethylether và ethanol với tỉ lệ 1:1, đánh tan chúng bằng vi sóng. Nếu dung dịch không màu hay có màu tương phản với mày hồng của chỉ thị với NaOH thì ta chuẩn độ bằng NaOH 0,05M với chỉ thị phenolphthalein. Ngược lại nếu có màu không tương phản với màu hồng của chỉ thị với NaOH thì ta chuẩn độ có thêm điện cực hoặc chuẩn độ điện thế. Dựa vào lượng thể tích NaOH đã dùng tính toán hàm lượng axit béo tự do.

97

3.1.3. HÓA CHẤT

− Dichloromethane (CH2Cl2)

− Hỗn hợp dung môi: Hỗn hợp gồm 50% Diethylether và 50% Ethanol (95% trong nước). Các hỗn hợp dung môi phải trung hòa với với dung dịch NaOH 0,05M. Khi dùng chỉ thị phenolphthalein

− Natri hidroxit (NaOH 0.05M)

− Chỉ thị Phenolphtalein, 10g/L trong Ethanol (95%)

3.1.4. THIẾT BỊ

Máy rữa siêu âm (dùng để chiết axit béo)

Phễu lọc

98 Beaker Vial 20ml Buret Giấy lọc Bếp điện

99

Máy đo pH

3.1.5. CHUẨN BỊ MẪU

Chuẩn bị một tờ giấy trắng nhỏ sạch, dùng kéo cắt nhỏ mẫu da với kích thước 25mm hoặc cắt mịn trên tờ giấy để tránh mất mẫu và nhiễm mẫu, sai số trong phép đo.

Hình 3.1.5.1: Mẫu da cắt nhỏ

Hình 3.1.5.2: Mẫu da cắt mịn

100

3.1.6. CHUẨN BỊ CHẤT THỬ CHUẨN [4]

Cân 0.2g NaOH cho vào bình định mức 100ml và định mức lên 100ml bằng ethanol. Sau đó vừa ngâm bình định mức vào nước và lắc cho NaOH tan hoàn toàn trong ethanol.

Tuy nhiên, việc pha NaOH gặp nhiều khó khăn như sau:

NaOH dạng rắn là chất cực kỳ dễ hút ẩm, do đó lượng NaOH thực tế không đúng bằng lượng NaOH đem cân mà lẫn ít nước.

Trong quá trình bảo quản NaOH trong bình, nồng độ NaOH cũng bị giảm theo thời gian. Do trong không khí của chúng ta có khí CO2, là một acid yếu khi tan trong nước sẽ tác dụng với NaOH tạo NaHCO3 và Na2CO3 gây giảm nồng độ của chất thử chuẩn NaOH.

Vì vậy, khi pha dung dịch NaOH, ta phải làm thật nhanh và đậy kín bình chứa để tránh CO2 tác dụng với NaOH gây giảm nồng độ NaOH. Như vậy, nồng độ NaOH ko đúng như ta tính, không thể dùng để chuẩn axit.

Khi đó, ta phải dùng một chất chuẩn khác xác định chính xác nồng độ NaOH đã pha, những chất chuẩn như thế gọi là "chất chuẩn gốc", dùng để chuẩn những chất chuẩn. Những chất chuẩn gốc này tương đối dễ bảo quản, độ tinh khiết hóa học cao (99,9%), thành phần thể rắn cũng như thể lỏng đúng như công thức của nó. Trong trường hợp này, ta dùng axit oxalic (H2C2O4) để chuẩn chính xác nồng độ NaOH, rồi sau đó mới dùng NaOH chuẩn những axit khác.

Vì những yêu cầu trên, trong hóa phân tích, những chất chuẩn đều có thời gian sử dụng, thường chỉ được sử dụng trong 1 ngày, thậm chí chỉ trong 1 buổi. Sau đó phải xác định lại chính xác nồng độ.

3.1.7. CHUẨN BỊ CHỈ THỊ

101

3.1.8. SƠ ĐỒ QUY TRÌNH TIẾN HÀNH

Sơ đồ 3.1.8.1: Sơ đồ tồng quát quá trình phân tích axit béo tự do

Cân 2g mẫu cho vào vial 20ml

Thêm 10ml CH2Cl2

Đống kín vial

Siêu âm bằng vi sóng 50oC, 4h

Lọc dung môi chiết

Làm bay hơi CH2Cl2 Bay hơi tự nhiên

Siêu âm

Thêm 10ml hỗn hợp dung môi Diethylether và Ethanol tỉ lệ 1:1 và 2-3 giọt Phenolphtalein Chuẩn độ Làm lạnh Tính toán kết quả Chuẩn độ bằng NaOH với chỉ thị PP Chuẩn độ bằng NaOH với điện cực pH

102 Ghi chú:

Thêm 10ml hỗn hợp dung môi Diethylether và Ethanol vào phần cặn còn lại gia siêu âm để các phần cặn này tan trong dung môi.

Chuẩn độ bằng NaOH với chỉ thị PP khi dung môi không màu hoặc có màu tương phản với màu hồng của chỉ thị PP trong môi trường bazo tại điểm tương đương.

Chuẩn độ bằng NaOH với điện cực pH khi dung môi có màu mà tại điểm tương đương khó nhìn thấy sự đổi màu của PP trong môi trường bazo.

3.1.9. TÍNH TOÁN[5]

Hàm lượng axit béo được tính bởi công thức sau: Tính theo axit oleic vì axit oleic có số Cacbon và khối lượng phân tử trung bình với các axit béo khác mặc khác hằng số phân ly axit ka bằng với các axit béo khác.

% 𝑎𝑥𝑖𝑡 𝑏é𝑜 = 𝑉. 28,2. 𝐹 𝑀𝑜

Trong đó: V: Thể tích NaOH dùng để chuẩn độ (ml) F: Phân tử mol của NaOH (0.05M)

Mo: Khối lượng mẫu (g) Để chuyển từ % axit ra giá trị axit ta nhân 1,99

103

3.1.10. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TỔNG KHỐI LƯỢNG CÁC CHẤT CHIẾT RA BẰNG DICHLOROMETHAN CHIẾT RA BẰNG DICHLOROMETHAN

Cân 2g da cắt nhỏ (24mm) đã được sấy ở 110oC trong 4h trước khi cân cho vào trong vial 20ml, sau đó thêm 10ml dichloromethane đậy kín vial và siêu âm ở 50oC trong 3h. Lọc lấy phần mẫu, sau đó sấy ở 110oC cân phân tích xác định khối lượng M1.

Tính toán tổng khối lượng (W) bằng công thức sau:

𝑊 = 𝑀𝑜− 𝑀1

𝑀𝑜 . 100 (%)

Trong đó:

Mo: khối lượng mẫu ban đầu đem cân (2g)

M1: khối lượng mẫu sau khi chiết bằng dichloromethan

3.2. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘ ẨM

Theo nguyên tắc: áp dụng phương pháp sấy khô đến sản phẩm không đổi. Tiến hành: sấy cốc cân sạch trong tủ sấy ở nhiệt độ 105oC (TCVN) đến trọng lượng không đổi, dùng cân phân tích cân xác định trọng lượng cốc cân mo (g). Cân 45g da cắt nhỏ 24mm, đem cân phân tích, ghi nhận khối lượng, khi đó tổng lượng cốc cân và mẫu là m1(g).

Đặt cốc vào tủ sấy đang ở nhiệt độ 105oC (TCVN), sấy khoảng 4 giờ thì lấy cốc mẫu ra để nguội 15 phút trong bình hút ẩm có chất hút ẩm. Cân cốc mẫu đã sấy. Cân xong để cốc vào sấy tiếp khoảng 2 giờ thì cân lại lần nữa cho đến khi trọng lượng cốc mẫu giữa các lần sấy không thay đổi. Ghi nhận khối lượng m2(g)

104 Kết quả tính độ ẩm: (w)

𝑤 = 𝑚1− 𝑚2

𝑚1− 𝑚𝑜. 100 (%)

Trong đó:

mo: Khối lượng cốc sau khi sấy đến khối lượng không đổi m1: Khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy

m2: Khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi.

3.3. QUÁ TRÌNH KHẢO SÁT

Mẫu dùng để khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết, kích thước mẫu, nhiệt độ siêu âm, dung môi chiết, tổng khối lượng các chất chiết ra và khảo sát độ ẩm là mẫu da bò có màu trắng đục, bề mặt sần sùi, mùi hôi hơi tanh.

Hình 3.3.1: Mẫu da bò dùng cho quá trình khảo sát

3.3.1. KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG THỜI GIAN CHIẾT ĐẾN LƯỢNG AXIT BÉO THU ĐƯỢC BÉO THU ĐƯỢC

Khảo sát sự phụ thuộc của tổng lượng axit chiết được trong da vào thời gian chiết bằng phương pháp trích ly bằng vi sống với dung môi dichloromethan, được tiến hành như sau: Cho vào 8 vial 20ml mỗi vial 2g da cắt nhỏ với kích thước khoảng 24mm sau đó thêm 10ml dichloromethan, đậy kín vial và siêu âm 4h. Với khoảng thời gian cách nhau 30 phút ta lấy 1 vial và lọc dung môi chiết được. Làm bay hơi dung môi. Sau đo thêm 10ml diethylether và ethanol và 1 hoặc 2 giọt chỉ thị phenolphtalein và chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,05M để xác định tổng axit béo trong mỗi 30 phút. Làm 2 lần thí nghiệm lấy kết quả trung bình.

105 Số lần TNo Thời gian (h) 1 2 V NaOH (ml) Trung bình % hàm lượng axit béo tự do FNaOH (mol/l) Mo (g) VNaOH (ml) FNaOH (mol/l) Mo (g) VNaOH (ml) 0.5 0.05 2 0.30 0.05 2 0.30 0.30 0,2115 1.0 0.05 2 0.25 0.05 2 0.35 0.30 0,2115 1.5 0.05 2 0.35 0.05 2 0.45 0.40 0,2820 2.0 0.05 2 0.45 0.05 2 0.55 0.50 0,3525 2.5 0.05 2 0.50 0.05 2 0.50 0.50 0,3525 3.0 0.05 2 0.50 0.05 2 0.60 0.55 0,3878 3.5 0.05 2 0.55 0.05 2 0.55 0.55 0,3878 4.0 0.05 2 0.50 0.05 2 0.60 0.55 0,3878

Bảng 3.2.1.1: Bảng kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian siêu âm

Đồ thị 3.2.1.2: Đồ thị thể hiện hàm lượng axit béo thông qua thời gian chiết

Nhận xét: Trong quá trình khảo sát trên, ở thời gian đầu tổng hàm lượng axit béo tăng và đạt kết quả tốt nhất sau 3 giờ. Nếu tiếp tục tăng thời gian chiết thì hàm lượng axit gần như ổn định. Vì vậy thời gian 3 giờ là thời gian chiết tối ưu.

106

3.3.2. KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA KÍCH THƯỚC MẪU ĐẾN LƯỢNG AXIT BÉO THU ĐƯỢC AXIT BÉO THU ĐƯỢC

Khảo sát sự phụ thuộc của tổng lượng axit chiết được trong da vào kích thước mẫu và được trích ly bằng phương pháp trích ly bằng vi sống với dung môi dichloromethan, được tiến hành như sau: Lấy 2 vial 20ml cho vào vial thứ nhất 2g da cắt nhỏ với kích thước khoảng 24mm và cho vào vial thứ hai 2g da cắt mịn sau đó thêm 10ml dichloromethan vào 2 vial, đậy kín vial và siêu âm 3h. Lọc dung môi chiết và làm bay hơi dung môi. Sau đó hòa tan bằng 10ml hỗn hợp dung môi diethylether và ethanol, và 1 hoặc 2 giọt chỉ thị phenolphtalein rồi chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,05M để xác định tổng axit béo. Làm 2 lần thí nghiệm lấy kết quả trung bình.

Số lần TNo Số Vial 1 2 VNaOH (ml) Trung bình % hàm lượng axit béo tự do FNaOH (mol/l) Mo (g) VNaOH (ml) FNaOH (mol/l) Mo (g) VNaOH (ml) 1 0.05 2 0.35 0.05 2 0.45 0.40 0.2820 2 0.05 2 0.45 0.05 2 0.55 0.50 0.3525

Bảng 3.2.2.1: Bảng kết quả khảo sát ảnh hưởng kích thước mẫu

Đồ thị 3.2.2.2: Đồ thị thể hiện hàm lượng axit béo với kích thước mẫu

Nhận xét: Với mẫu cắt mịn thì tổng hàm lượng axit béo chiết ra nhiều hơn so với mẫu cắt nhỏ.

107

3.3.3. KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ SIÊU ÂM ĐẾN LƯỢNG AXIT BÉO THU ĐƯỢC AXIT BÉO THU ĐƯỢC

Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ siêu âm, được tiến hành như sau: Lấy 3 vial 20ml, cho vào 2g mẫu da cắt nhỏ vào mỗi vial 20ml sau đó thêm 10ml dichloromethan đống kín vial 20ml lại. Vial 20ml thứ nhất siêu âm ở nhiệt độ 40oC, Vial 20ml thứ 2 siêu âm ở nhiệt độ 50oC, Vial 20ml thứ 3 siêu âm ở nhiệt độ 60oC. Sau đó chuẩn độ bằng NaOH 0,05M để xác định lượng tổng axit béo. Làm 2 lần thí nghiệm lấy kết quả trung bình. Số lần TNo Nhiệt độ (oC) 1 2 VNaOH (ml) Trung bình % Hàm lượng axit béo tự do FNaOH (mol/l) Mo (g) VNaOH (ml) FNaOH (mol/l) Mo (g) VNaOH (ml) 40 0.05 2 0.35 0.05 2 0.45 0.40 0.2820 50 0.05 2 0.45 0.05 2 0.55 0.50 0.3525 60 0.05 2 0.50 0.05 2 0.50 0.50 0.3525

Bảng 3.2.3.1: Bảng kết quả khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ siêu âm

Đồ thị 3.2.3.2: Đồ thị thể hiện hàm lượng axit béo qua nhiệt độ siêu âm

Nhận xét: Siêu âm ở nhiệt độ từ 40oC đến 60 oC thì tổng hàm lượng axit béo tăng lên nhưng ở nhiệt độ từ 50oC thì tổng hàm lượng axit béo chiết ra gần như ổn định. Vậy nhiệt độ siêu âm tốt nhất là ở 50oC cho quá trình chiết.

108

3.3.4. KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA DUNG MÔI CHIẾT ĐẾN HÀM LƯỢNG AXIT BÉO LƯỢNG AXIT BÉO

Khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết đến hàm lượng axit béo được tiến hành như sau: Lấy 3 vial 20ml cho vào mỗi vial 2g da cắt nhỏ. Vial thứ nhất chiết bằng dichloromethane, vial thứ 2 chiết bằng t-BME và vial thứ 3 chiết bằng hexan. Siêu âm trong 3h sau đó lọc dung môi thu được và làm bay hơi dung môi (cho bay hơi tự nhiên). Sau khi dung môi bay hơi hết ta hòa tan phần cặn với 10ml hỗn hợp dung môi diethyether:ethanol và chuẩn độ bằng NaOH 0,05 M để xác định hàm lượng tổng axit béo trong 2 vial khi chiết bằng 2 dung môi khác nhau. Lập lại thí nghiệm 2 lần lấy kết