2.2.3.1. Các phương trình lưu giữ
− Thời gian lưu giữ :
Các chất tan trong hỗn hợp mẫu phân tích, khi được nạp vào cột sắc ký, chúng sẽ bị lưu giữ ở trong một cột tách (trên pha tĩnh) theo một thời gian nhất định. Đó là thời gian lưu của nó trong hệ cột đã cho. Thời gian này được tính từ lúc nạp mẫu vào cột tách sắc ký cho đến lúc chất tan được rữa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại. Như vậy, nếu gọi tRi là thời gian lưu tổng cộng của chất tan i thì chúng ta luôn có:
tRi = ( t0 + t’Ri )
Trong đó t0 là thời gian không lưu giữ (thời gian chất tan nằm trong pha động) và t’Ri là thời gian lưu giữ thực của chất i ở trong cột sắc ký.
Nếu hai chất A và B kế tiếp nhau trong sắc đồ thì chúng ta có : = ( t’B / t’A )
được gọi là thời gian lưu tương đối của hai chất A và B, hay hệ số tách của hai chất đó. Đại lượng càng lớn thì sự tách của hai chất A và B càng rỏ ràng. Còn khi đại lượng này bằng 1, thì không có sự tách sắc ký của hai chất A và B, lúc này hai chất A và B nằm trong một peak sắc ký. Còn nếu gần bằng 1, thì peak sắc ký của
56
hai chất A và B có chung một vùng. Nghĩa là chúng chập nhau không thể tách thành hai peak riêng biệt đặc trưng cho hai chất đó.
− Thể tích lưu
Thể tích lưu của một chất là thể tích của pha động chảy qua cột sắc ký trong khoảng thời gian kể từ lúc mẫu được bơm vào cột cho đến khi chất tan được rửa giải ra ở thời điểm có nồng độ cực đại, nghĩa là tương đương với thời gian lưu t’Ri. Nếu chất tan không bị lưu giữ trong cột tách thì thể tích lưu của nó sẽ bằng thể tích Vm của pha động chảy qua cột. Như vậy, nếu gọi F (mL/phút) là tốc độ của pha động được bơm qua cột sắc ký, thì chúng ta có: VRo = Vm = tRo . F VRi = F . tRi Hay VRi = VRo ( 1 + K’i) Mặt khác ta có : ( Vs + Vm ) = Vo
Trong đó V0 là thể tích trống toàn phần của cột sắc ký, Vs là thể tích thực của pha tĩnh trong cột. Nhưng vì Vm = F . tRo nên chúng ta có :
Vs = ( Vo – F.tRo )
Như vậy, nhờ công thức này chúng ta có thể tính được thể tích thực Vs của pha tĩnh ở trong cột sắc ký.
57
2.2.3.2. Hệ số phân bố và hệ số dung tích
Quá trình tách sắc ký của các chất là dựa trên sự phân bố của chất tan giữa pha động và pha tĩnh xảy ra liên tục trong quá trình sắc ký. Sự phân bố này được đặc trưng bởi một đại lượng đươc gọi là hệ số phân bố Ki của chất i. Hệ số này được định nghĩa là tỷ số nồng độ của chất tan i ở trong pha tĩnh và pha động và được tính bằng công thức :
Ki = Ci (s) / Ci (m)
Trong đó Ci (s) và Ci (m) là nồng độ của chất tan i trong pha tĩnh và trong pha động. Hệ số Ki cho ta biết khả năng phân bố của chất i như thế nào trong mỗi pha (pha đông và pha tĩnh).
Nhưng hệ số Ki chưa nói lên được sức chứa (dung tích) của cột sắc ký. Vì thế người ta phải đưa thêm vào hệ số dung tích K’i. Hệ số dung tích K’i (hay hệ số dung lượng : Capacity coefficient) là chỉ cho ta biết tỷ số khối lượng của chất tan i phân bố trong mỗi pha là bao nhiêu; nghĩa là ta có :
K’i = m(S) / m(M)
Nếu trong hỗn hợp mẫu có hai chất A và B thì cũng tương tự như trong khái niệm lưu giữ chúng ta cũng có :
= K’B / K’A = ( tB – t0 ) / ( tA – to )
Như vây, từ tỷ số của hệ số dung tích () của hai chất cũng cho ta biết khả năng tách của hai chất kề nhau trong một hệ sắc ký đã chọn. Ở đây khi khác càng nhiều thì sự tách của hai chất càng rỏ ràng.
2.2.3.3. Tốc độ tuyến tính của pha động
Trong kỷ thuật HPLC, tốc độ thể tích F (mL/phút) của pha động luôn liên quan đến tiết diện của cột tách. Vì thế người ta ít dùng khái niệm này, khi xem xét sự di chuyển của một đĩa chất tan trong cột tách, mà thường dùng tốc độ tuyến tính (cm/gy). Khái niệm tốc độ này cho ta biết trong một đơn vị thời gian (1 gy hay 1 ph), thì pha động, hay một đĩa sắc ký của chất tan dịch chuyển được bao nhiêu cm trong
58
cột. Tốc độ này không phụ thuộc vào tiết diện của cột tách và cũng không phụ thuộc vào độ giảm áp trong cột tách theo chiều dài từ đầu cột đến cuối cột. Tốc độ này được tính theo công thức:
u = L / t0
Hay ta có :
u = F/ ( r2.ET.)
Trong đó L là chiều dài (cm), r là bán kính của cột sắc ký (mm), ET là hệ số về độ xốp của pha tĩnh.
2.2.3.4. Độ thấm dung môi của pha tĩnh
Để đánh giá một cột tách HPLC có tốt hay không, sau khi nạp người ta phải kiểm tra lại cột theo ba yếu tố:
- Số đĩa của cột (hay chiều cao một đĩa). - Độ cân đối của peak sắc ký.
- Độ thấm dung môi của hệ pha.
Khác với độ cân đối của peak, độ thấm dung môi (pha động) của một hệ pha lại cho chúng ta biết độ ổn định, tính cân bằng và tính lặp lại của hệ pha đó trong quá trình sắc ký. Đồng thời cũng một phần nào mô tả sự diễn biến của các cân bằng phân bố trong hệ pha tốt hay không tốt. Tất nhiên đó chỉ là một tham số, mà thực tế còn nhiều yếu tố khác ảnh hưởng đến vấn đề này.
2.2.3.5. Số đĩa và chiều cao của đĩa trong cột sắc ký
Theo lý thuyết đĩa, để đặc trưng cho một cột tách sắc ký, người ta dùng khái niệm số đĩa N. Đây là một đại lượng, về hình thức có thể coi mỗi đĩa trong cột sắc ký như là một lớp chất nhồi có chiều cao (bề dày) là H. Tất nhiên đây là lớp có tính chất động, và bề dày H của nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố như :
- Đường kính của hạt pha tĩnh, hình dạng và kiểu hạt tròn hay mảnh. - Độ xốp, kích thước lỗ xốp của pha tĩnh.
59
- Bản chất, cấu trúc phân tử của chất tan (chất phân tích ). - Tốc độ và thành phần của pha động trong quá trình sắc ký. - Độ nhớt của pha động.
Vì thế với một hệ pha nhất định, và trong những điều kiện sắc ký đã chọn thì chiều cao H cũng có những giá trị xác định ứng với các chất tan, chiều cao H này được xác định theo công thức:
H = ( L/ 16) . ( W/ tRi )2
Đây chính là chiều cao lý thuyết của một đĩa.
2.2.3.6. Khả năng phân giải
Hai đại lượng H và N đã nói ở trên là các hằng số đặc trưng cho một loại cột tách, nhưng chúng chưa chỉ rỏ cho chúng ta biết, hai chất A và B được tách ra khỏi nhau đến mức nào, khi nó được rữa giải ra khỏi cột sắc ký. Vì thế để đánh giá độ tách của các chất trong một hệ pha, người ta còn phải cần thêm đại lượng độ phân giải R
và nó được xác định theo công thức :
RAB = 2.( t’RA – t’RB )/ ( WA + WB )
Ở đây t’RA và t’RB là thời gian lưu hiệu lực của hai chất A và B; còn WA và WB là chiều rộng đáy của peak sắc ký của hai chất A và B.
2.2.3.7. Độ phát hiện
Độ phát hiện của một chất trong một hệ pha đã chọn là phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau của quá trình sắc ký, cụ thể như :
- Thể tích hay lượng mẫu được nạp vào cột tách. - Tính chất và các thông số đặc trưng của pha tĩnh.
- Tính chất và thành phần của pha động (có khi cả giá trị pH). - Tốc độ của pha động và kỹ thuật rữa giải.
- Độ nhạy của phát hiện của Detector và các đặc trưng của nó. - Hệ thống đường ống dẫn (từ van mẫu đến flowcell của Detectơ).
60
- Tính chất của chất phân tích đối với kỹ thuật phát hiện. - Thiết bị để ghi đo tín hiệu của chất phân tích,....
Các yếu tố này đều ảnh hưởng trong những mức độ khác nhau đến độ phát hiện của một chất phân tích. Như vây, nếu ta chọn được các yếu tố trên ở điều kiện thích hợp nhất, thì chúng chúng ta sẽ có độ nhạy và độ phát hiện tốt nhất, và lúc này độ phát hiện chỉ còn do bản chất của chất phân tích quyết định mà thôi.
2.2.3.8. Nồng độ chất tan trong quá trình sắc ký
Trong quá trình sắc ký, nếu ta nạp vào cột tách một thể tích mẫu là VS ml, thì lượng chất phân tích i được nạp vào cột tách đó sẽ là :
Ql = VS . Cl S
Như thế nồng độ cực đại của chất tan i được rửa giải ra ứng với thời gian lưu tRi
sẽ là:
𝐶1,𝑚𝑎𝑥 = 𝑄1 √2. 𝜋. 𝜕𝑣1
Trong đó vl là độ lệch chuẩn theo thể tích của chất tan Xi .
2.2.3.9. Độ lệch chuẩn
Độ lệch chuẩn là một đại lượng đặc trưng cho một peak sắc ký và một quá trình tách sắc ký của một hỗn hợp. Theo qui luật phân bố Gauss, độ lệch chuẩn này được xác định bởi chiều rộng của peak sắc ký ứng với 0,607 chiều cao của peak sắc ký Hmax ...