Phytophthora sp gây hại
3.1. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Mẫu phân lập Phytophthora sp. – vi sinh vật giống nấm. - Bệnh: Bệnh chảy gôm hại Sầu riêng.
3.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu - Địa điểm: - Địa điểm:
+ Một số địa điểm trồng Sầu riêng tại Đắk Lắk.
+ Phòng thí nghiệm, bộ môn Bệnh cây và miễn dịch thực vật, Viện Bảo vệ thực vật.
+ Phòng thí nghiệm, bộ môn Bệnh cây, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. -Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 4/2019 đến tháng 4/2020.
3.1.3. Vật liệu, dụng cụ nghiên cứu
- Giống sầu riêng trồng phổ biến trong sản xuất: thái lan, chín sớm, ri6… - Các mẫu bệnh thu thập do nấm phytophthora sp.hại sầu riêng
- Tủ sấy, nồi hấp, lò vi sóng, tủ lạnh, tủ định ôn, giấy quỳ, cân điện, buồng cấy vi sinh, đĩa petri, ống nghiệm, dao mổ, que cấy nấm, khay đựng mẫu, bình phun...
Vật liệu: giấy thấm, màng Polyetylen, giấy Alumilium.
- Dụng cụ để thu thập mẫu gồm: Dao, kéo, dây chun, túi đựng mẫu...
- Môi trường nuôi cấy nấm: PSM, CA, CSA, WA, PDA,PCA, V8 – Juice...
Môi trường chọn lọc Phytophthora PSM
Agar 8g
Cà rốt nghiền nhuyễn 20ml (công thức bên dưới) Khoai tây nghiền nhuyễn 80ml (công thức bên dưới)
Đổ đầy thành 1l bằng nước cất, hấp và khi nguội xuống 55°C, thêm: Hymexazol 3.7ml dung dịch trong nước
Pimaricin 400µl
Penicillin 200mg
Bọc các đĩa môi trường bằng giấy nylon và cất trong tủ lạnh tránh tiếp xúc với ánh sáng. Loại bỏ môi trường sau một tháng.
Cà rốt nghiền nhuyễn
Rửa, cắt viên 400g cà rốt và hấp 10 phút trong 400ml nước cất. Nghiền nhuyễn rồi thêm 500ml nước. Có thể chia ra trong hộp nhựa và để ngăn đá đến khi cần dùng.
Khoai tây nghiền nhuyễn
Cắt viên 200g khoai tây và đun trong 500ml nước máy cho đến khi mềm. Nghiền nhuyễn và thêm nước cho đủ 800ml. Cất giữ như trên.
Dung dịch mẹ Hymexazol
Cho 0,3g hymexazol nguyên chất vào 20ml nước tiệt trùng.
Pimaricin
Pimaricin có thể được trực tiếp thêm vào agar lỏng. Lắc đều trước khi dùng. Gói bằng giấy nhôm và dự trữ trong tủ lạnh.
Môi trường Cà rốt nghiền nhuyễn (CA)
Thành phần: + Cà rốt: 400g + Nước cất:1000ml
Cách làm: 400g cà rốt cắt lát mỏng, cho 400ml nước vào hấp trong 10 phút. Sau đó nghiền nhuyễn rồi thêm 500ml nước vào Sau đó lấy ra 100ml nước cà rốt nghiền nhuyễn, thêm 40g agar và thêm nước vào cho thành 1l và cho vào bình tam giác, hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút, hấp xong cho môi trường vào hộp lồng đậy nắp lại, khi môi trường nguội thì cấy nấm vào môi trường. Nếu chưa dùng ngay thì quấn màng chống nhện, cho các hộp này vào túi nilon trắng sạch buộc miệng túi lạị bằng dây chun để chống nhện nhỏ xâm nhập vào đĩa, để vào khay nhựa, cất vào tủ để sử dụng dần trong 2-3 ngày sau.
Môi trường Cà rốt – đường - aga (CSA) Thành phần: + Cà rốt: 200 gam + Saccarose: 20gam + Aga: 20gam + Nước cất:1.000 ml
Cách làm: 200g cà rốt cắt lát mỏng luộc nhừ với 1l nước sau đó lọc qua vải màn lấy nước trong. Thêm 20g Saccarose và 20g agar vào khuấy tan, đun sôi. Sau đó cho vào bình tam giác hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút,, hấp xong cho môi trường vào hộp lồng đậy nắp lại, khi môi trường nguội thì cấy nấm vào môi trường. Nếu chưa dùng ngay thì quấn màng chống nhện. cho các hộp này vào nilon trắng sạch buộc miệng túi lại bằng dây chun để chống nhện nhỏ xâm nhập vào đĩa, để vào khay nhựa, cất vào tủ để sử dụng trong 2-3 ngày.
Môi trường PDA ( Potato + Glucozo + agar : Khoai tây – D glucozo – agar):
Thành phần:
- Khoai tây : 200 gam - D Glucozo: 20 gam - Agar : 20 gam - Nước cất: 1.000 ml
Cách làm: 200 gam khoai tây gọt sạch cắt lát mỏng luộc nhừ vơi 1 lít nước sau đó lọc qua lớp vải màn lấy nước trong. Cho nươc khoai tây, đường, agar vào xông quấy đều. Cho xoong lên bếp vừa đun vừa quấy đềy tay cho sôi đều rồi đổ vào bình tam giác, hấp khử trùng ở 121ºC trong 25 phút, hấp xong cho môi trường vào hộp lồng đạy nắp lại, khi môi trường nguội thì cấy nấm vào môi trường. Nếu chưa dùng ngay thì quấn màng chống nhện, cho các hộp này vào túi nilon trắng sạch buộc miệng túi lại bằng dây chun để chống nhện nhỏ xâm nhập vào đĩa, để vào khay nhựa, cất vào túi để sử dụng dần trong 2-3 ngày.
Môi trường PCA:
Cách làm: Khoai tây 20 gam, cà rốt 20 gam, Agar 20 gam, nước cất 1000 ml. Nấu nhừ khoai tây, cà rốt, lọc qua vải màn thêm nước cất cho đủ 1000 ml, cho 20 gam Agar vào quấy đều, đun sôi cho Agar tan đều, cho vào bình tam giác
và hấp khử trùng ở 121°C, 1.5 atm trong 30 phút. sau khi hấp khử trùng để môi trường nguội khoảng 55-60oC cho thêm dung dịch hóa chất sau vào:
- Piramicin 10ppm: (0,4ml hòa trong hộp nhựa nhỏ chứa 6,7ml nước cất vô trùng) - Rifampicin 50ppm: (0,05g hòa vào hộp nhỏ chứa 6,7ml methanol)
- Hymexazol: (0,05g hòa trong 6,7 ml nước cất vô trùng), sau đó đổ ra các đĩa peptri đã được khử trùng và sử dụng để cấy nấm. Nếu chưa dùng ngay thì quấn màng chống nhện, cho các hộp này vào túi nilon trắng sạch buộc miệng túi lại bằng dây chun dể chống nhện nhỏ xâm nhập vào đĩa, để vào khay nhựa, cất vào túi để sử dụng dần trong 2-3 ngày.
Môi trường V8 – Juice
Thành phần: V8 – Juice 200 ml Agar 15 g CaCO3 3 g Nước cất 1000 ml
Cách làm: Quấy đều, nấu tan Agar, cho vào bình tam giác, và hấp khử trùng ở 121°C, 1.5 atm trong 30 phút. Sau đó đem đổ ra các đĩa peptri đã được khử trùng và sử dụng để cấy nấm. Nếu chưa dùng ngay thì quấn màng chống nhện, cho các hộp này vào túi nilon trắng sạch buộc miệng túi lại bằng dây chun dể chống nhện nhỏ xâm nhập vào đĩa, để vào khay nhựa, cất vào túi để sử dụng dần trong 2-3 ngày.
Hóa chất sử dụng: Cồn 900 C, cồn 960 C, Cồn 700 C, nước cất, khoai tây, đường xaccazose, đường Glucose, bột mạch…
Thuốc bảo vệ thực vật: Một số thuốc trừ nấm chứa hoạt chất sau:
STT Tên hoạt chất Tên thuốc thành phẩm Công ty sản xuất
1 Mancozeb + Metalaxyl Ridomil Gold 68WP Syngenta 2 Dimethomorph + Mancozeb Acrobat MZ 90/600WP D-BASF
3 Fosetyl aluminium Aliette 800WG Bayer-Việt Nam 4 Phosphorous acid Agri-fos 400 Donatechno 5 Hexaconazole Anvil 5SC Syngenta