PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU BỆNH CHẢY GÔM DO PHYTOPHTHORA
4.2.6. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học Phytophthora sp gây bệnh chảy
gôm hại thân cây sầu riêng
4.2.6.1. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng, phát triển Phytophthora sp. gây bệnh chảy gôm hại thân cây sầu riêng
Môi trường nuôi cấy nhân tạo là yếu tố ảnh hưởng rất quan trọng đến sự sinh trưởng và phát triển của các loài vi sinh vật nói chung và của nấm bệnh nói riêng. Mỗi loài nấm có thể phát triển trên môi trường đặc hiệu nhất định. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các môi trường nuôi cấy nhân tạo khác nhau có ảnh hưởng lớn đến đặc điểm phát sinh, phát triển của Phytophthora sp. Vì vậy để lựa chọn được loại môi trường dinh dưỡng nhân tạo thích hợp cho Phytophthora sp. phát triển, cũng như nhân nuôi loài nấm này phục vụ các công tác nghiên cứu về sau, nấm được tiến hành nuôi cấy trên 5 loại môi trường khác nhau là PDA; PCA; CA; Czapek; V8-juice ở ngưỡng nhiệt độ phòng. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 4.12.
Bảng 4.12. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy nhân tạo đến sự sinh trưởng, phát triển của Phytophthora sp.gây bệnh chảy gôm hại thân cây sầu riêng (Viện BVTV,
tháng 8/2019) STT Môi trường
nuôi cấy
Đường kính tản nấm các ngày sau nuôi cấy (mm)
2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày
1 PDA 28,0d 35,6c 37,4e 50,2d 2 PCA 47,2a 63,0a 78,8c 84,6b 3 CA 43,6b 64,0a 81,6b 90,0a 4 Czapek 37,6c 54,8b 71,6d 81,8c 5 V8-Juice 47,0a 63,6a 85,8a 90,0a 6 LSD0,05 0,99 0,99 0,89 0,65 7 CV(%) 1,8 1,3 1,0 0,6
Kết quả bảng 4.12 cho thấy Phytophthora sp. gây bệnh chảy gôm hại thân cây sầu riêng đều có khả năng sinh trưởng, phát triển trên cả 5 loại môi trường thí nghiệm. Tuy nhiên, chúng phát triển tốt nhất trên môi trường V8-Juice với đường kính tản nấm sau 2 ngày nuôi cấy đã đạt 47,0mm và sau 4 ngày nuôi cấy là 85,8 mm,đặc điểm tản nấm dày màu trắng, hệ sợi phát triển mạnh đâm tia xung quanh như đám mây, sợi nấm mọc bám sát bề mặt môi trường. Sau 5 ngày theo dõi thì tản nấm mọc kín đĩa petri.
Các môi trường như PCA, CA cũng khá thích hợp cho nấm phát triển với đường kính tản nấm sau 4 ngày lần lượt là 78,8 mm và 81,6 mm, tuy nhiên trên 2
loại môi trường này sợi nấm mọc thưa thớt hơn, không đặc trưng và bông xốp lên phía trên bề mặt môi trường. Môi trường Czapek và PDA không thích hợp nhân nuôi loài nấm này, đường kính tản nấm chỉ đạt lần lượt 71,6 mm và 37,4 mm sau 4 ngày nuôi cấy. Trên môi trường Czapek tản nấm mọc thưa, màu trắng nhạt rất khó nhìn thấy bằng mắt thường. Trên môi trường PDA thì sợi nấm phát triển chậm, tuy tản nấm mọc có hình thái đặc trưng của Phytophthora nhưng sau cấy thường từ 7 đến 10 ngày nấm mới mọc kín đĩa.
Hình 4.7. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy nhân tạo đến sự sinh trưởng, phát triển của Phytophthora sp.(sau 5 ngày)
4.2.6.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng, phát triển của Phytophthora
sp. gây bệnh chảy gôm hại thân cây sầu riêng
Nhiệt độ là yếu tố sinh thái quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của nấm Phytophthora sp. Bên cạnh đó thì việc xác định chính xác ngưỡng nhiệt độ thích hợp cho nấm bệnh phát triển là rất cần thiết để từ đó có thể dự đoán thời điểm phát sinh và gây hại của bệnh phục vụ công tác dự tính, dự báo. Để tìm hiểu về vấn đề này, tác nhân Phytophthora sp. đã được tiến hành nuôi cấy trên môi trường V8-Juice và đặt ở 7 mức nhiệt độ khác nhau, hàng ngày theo dõi sự phát triển của tản nấm, kết quả được trình bày ở bảng 4.13.
Bảng 4.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng, phát triển của
Phytophthora sp. gây bệnh chảy gôm hại thân cây sầu riêng (Viện BVTV, tháng 8 /2019)
STT Mức nhiệt độ ( oC)
Đường kính tản nấm các ngày sau nuôi cấy (mm)
2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày
1 10oC 5,0d 5,0e 5,0e 5,0d 2 15oC 5,0d 10,4d 14,8d 21,6c 3 20oC 21,6c 41,6c 45,6c 51,8b 4 25oC 31,4b 57,4b 71,6b 90,0a 5 30oC 35,4a 61,2a 81,4a 90,0a 6 35oC 5,0d 5,0e 5,0e 5,0d 7 40oC 5,0d 5,0e 5,0e 5,0d LSD0,05 0,46 0,51 0,51 0,35 CV(%) 2,3 1,5 1,2 0,7
Ghi chú: 5,0 mm - đường kính tản nấm ban đầu
Nấm Phytophthora sp. phát triển tốt nhất trong điều kiện nhiệt độ từ 250C đến 300C. Đường kính tản nấm đạt 71,6 – 81,4 mm sau 4 ngày nuôi cấy và sau 5 ngày nuôi cấy là 90,0mm. Ở điều kiện nhiệt độ từ 350C trở lên và 100C trở xuống nấm ngừng phát triển. Nấm phát triển kém ở điều kiện nhiệt độ 150C - 200C sau 5 ngày nuôi cấy đường kính tản nấm chỉ đạt 21,6 – 51,8 mm.
Hình 4.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng, phát triển của Phytophthora
4.2.6.3. Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự sinh trưởng, phát triển của Phytophthora sp. gây bệnh chảy gôm hại thân cây sầu riêng
Sự sinh trưởng và phát triển của các loài vi sinh vật phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện ngoại cảnh, mỗi loài yêu cầu một điều kiện nhất định. Trong các nguyên lí phòng trừ bệnh hại cây trồng, việc tạo điều kiện môi trường bất thuận cho sự phát sinh, phát triển của nấm gây hại là một nguyên lí cơ bản không thể thiếu. Trong các yếu tố môi trường tác động đến sự sinh trưởng, phát triển của nấm bệnh thì yếu tố pH giữ vai trò khá quan trọng. Việc xác định ngưỡng pH thích hợp cho nấm sinh trưởng tốt giúp chúng ta đưa ra được các biện pháp phòng trừ bệnh có hiệu quả.
Để tìm hiểu độ pH ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm
Phytophthora sp. gây bệnh chảy gôm, thí nghiệm được tiến hành trên môi trường V8-Juice với 9 ngưỡng pH khác nhau ở điều kiện nhiệt độ phòng. Kết quả theo dõi ở bảng 4.14.
Bảng 4.14. Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự sinh trưởng, phát triển của
Phytophthora sp. gây bệnh chảy gôm hại thân cây sầu riêng (Viện BVTV, tháng 8/2019)
STT Ngưỡng pH Đường kính tản nấm các ngày sau nuôi cấy (mm)
2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày
1 4,5 33,6f 53,0g 65,0h 81,2f 2 5,0 37,2de 54,8f 72,6e 85,8e 3 5,5 39,2bc 57,4e 73,6d 87,4d 4 6,0 40,6a 61,2cd 76,2c 89,2b 5 6,5 40,6a 63,2a 80,4a 90,0a 6 7,0 39,6b 62,8ab 78,4b 90,0a 7 7,5 38,6c 62,4b 76,2c 90,0a 8 8,0 37,6d 61,6c 71,0f 88,4c 9 8,5 36,6e 60,6d 70,2g 87,6d LSD0,05 0,68 0,74 0,72 0,52 CV(%) 1,4 1,0 0,8 0,5
Nấm Phytophthora sp. phát triển được trong phạm vi pH từ 4,5 đến 8,5. Ở ngưỡng pH thấp nhất 4,5 đường kính tản nấm sau 2 ngày là 33,6mm và phát triển ở các ngày tiếp theo, sau 5 ngày nuôi cấy tản nấm có đường kính đạt 81,2mm. Tại ngưỡng pH cao nhất 8,5 đường kính tản nấm phát triển cũng khá tốt sau 2 ngày đạt 36,6mm và sau 5 ngày là 87,6mm.
Tuy nhiên, tản nấm phát triển tốt nhất trong điều kiện pH trung tính từ 6,5- 7,5 với đường kính tản nấm sau 4 ngày nuôi cấy đạt lần lượt 80,4mm, 78,4mm,
76,2mm và sau 5 ngày nuôi cấy thì kín đĩa đạt 90,0mm. Kết quả giữa các công thức có sự sai khác nhưng chênh lệch không nhiều, chính vì vậy Phytophthora
sp. đều có khả năng phát triển trên cả môi trường có tính axit và tính kiềm. Ngưỡng pH tương đối rộng.
Hình 4.9. Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự sinh trưởng, phát triển của
Phytophthora sp.gây bệnh chảy gôm hại thân cây sầu riêng (sau 4 ngày)
4.2.6.4. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự sinh trưởng, phát triển của Phytophthora sp. gây bệnh chảy gôm hại thân cây sầu riêng
Thí nghiệm được thực hiện với 3 công thức chiếu sáng là sáng liên tục, tối liên tục và 12 giờ sáng xen kẽ 12 giờ tối. Ngoài theo dõi đường kính tản nấm sau các ngày nuôi cấy đã tiến hành thêm thí nghiệm nghiên cứu khả năng sinh bọc bào tử của Phytophthora sp. ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau và cho kết quả trình bày ở bảng 4.15.
Bảng 4.15. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự sinh trưởng, phát triển của
Phytophthora sp. gây bệnh chảy gôm hại thân cây sầu riêng (Viện BVTV, tháng 8/2019)
STT Điều kiện chiếu sáng
Đường kính tản nấm sau nuôi cấy (mm) Mật độ bọc bào tử/ml 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày
1 Sáng liên tục 41,2a 59,2a 77,6a 90,0a 4,35x105
2 Tối liên tục 40,4b 57,0b 76,6a 90,0a 1,28x105 3 ½ sáng + ½ tối 40,8ab 57,0b 77,0a 90,0a 2,14x105
4 LSD0.05 0,87 0,87 1,15 0,00 -
5 CV(%) 1,6 1,1 1,1 0,0 -
Kết quả thí nghiệm cho thấy, đường kính tản nấm ở các công thức thí nghiệm không có sự sai khác rõ rệt. Như vậy, điều kiện chiếu sáng khác nhau
không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của tản nấm Phytophthora sp. Tuy nhiên ánh sáng lại ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng sinh bọc bào tử của
Phytophthora sp. trong điều kiện chiếu sáng liên tục khả năng sinh bọc bào tử của Phytophthora là tốt nhất với mật độ đạt 4,35x105 bọc bào tử/ml sau 5 ngày theo dõi, điều kiện tối liên tục không thuận lợi cho khả năng sinh bào tử vì vậy mật độ chỉ đạt 1,28x105 bọc bào tử/ml.
Hình 4.10. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự sinh trưởng, phát triển của
Phytophthora sp. gây bệnh chảy gôm hại thân cây sầu riêng (sau 3 ngày)
4.2.7. Định danh loài Phytophthora sp. gây bệnh chảy gôm hại thân cây sầu riêng bằng phương pháp sinh học phân tử
Hiện nay để xác định chính xác một tác nhân gây bệnh cho cây trồng, người ta có thể dùng nhiều phương pháp khác nhau như dựa vào triệu chứng bên ngoài, đặc điểm hình thái, sinh học cũng như tính gây bệnh của chúng đối với cây ký chủ. Tuy nhiên,để nghiên cứu sâu và định danh được loài gây bệnh thì sự kết hợp giữa đặc điểm hình thái nấm và phân tích sinh học phân tử đóng vai trò quan trọng trong việc xác định chính xác tên loài. Trong các phương pháp nghiên cứu ở cấp độ phân tử áp dụng trong việc xác định tác nhân gây bệnh hại cây trồng thì việc phân tích trình tự vùng rDNA ITS (nuclear ribosomal internal transcribed spacers) được sử dụng phổ biến và có hiệu quả đối với tác nhân gây bệnh do nấm. Sau khi phân lập tác nhân gây bệnh chảy gôm và định danh đến tên chi loài nấm đựa trên đặc điểm hình thái quan sát được. Các isolate đại diện cho từng chi và đại diện cho các triệu chứng gây bệnh được chọn để định danh tới loài dựa vào sự phân tích ở cấp độ sinh học phân tử.
Tùy từng loài mà người ta lựa chọn phân tích vùng gen khác nhau. Đối với
Phytophthora sp. gây bệnh chảy gôm cây sầu riêng, chúng tôi đã lựa chọn vùng gene ITS (internally transcribed spacers) để giải trình tự và định danh loài. Các mẫu nấm này sau khi phân lập được làm thuần bằng phương pháp cắt đỉnh sinh trưởng và nuôi cấy trên môi trường PDA ở nhiệt độ 28°C. DNA của nấm được chiết theo phương pháp hướng dẫn của nhà sản xuấtkit Dneasy Plant Mini Kit của hãng Qiagen. Vùng ITS được nhân bằng cặp mồi ITS1 và ITS4.
M=>
Hình 4.11. Kết quả chạy điện di sau khi tinh sạch DNA
M: Ladder 100bp.
Sản phẩm thu được từ quá trình PCR được tinh sạch và gửi công ty VN.Dat sang Hàn Quốc để giải trình tự. Trình tự thu được sau đó được tìm kiếm và so sánh với các chuỗi gần gũi trên ngân hàng gene (GenBank) cho kết quả ở hình 4.12 và bảng 4.16 như sau:
Bảng 4.16. Kết quả xác định mẫu Phytophthora sp. gây bệnh chảy gôm hại thân cây sầu riêng bằng giải trình tự và tìm kiếm các chuỗi gần gũi trên GenBank
Mã số
GenBank Quốc gia Loài xác định % đoạn
so sánh
Mẫu đồng nhất trình tự
(%)
MN750010.1 Việt Nam Phytophthora palmivora 100 100 KP183963.1 Indonesia Phytophthora palmivora 100 99,88 MH219876.1 Thổ Nhĩ Kỳ Phytophthora palmivora 100 99,88 LC510501.1 Thái Lan Phytophthora palmivora 100 99,88 HQ237479.1 Colombia Phytophthora palmivora 100 99,88
Sau khi nhận được kết quả, các trình tự được lắp ráp và loại bỏ các đoạn nhiễu ở hai đầu và tiến hành so sánh với các trình tự có sẵn trên GenBank. Kết quả so sánh cho thấy các mẫu Phytophthora sp. thu thập được tại Đắk Lắk giống với Phytophthora palmivora với mức độ đồng nhất trình tự lên tới 99.88% đến 100% trên toàn bộ đoạn so sánh. Như vậy, có thể kết luận rằng: tác nhân gây bệnh chảy gôm cây sầu riêng tại Đắk Lắk chính là loài Phytophthora palmivora.