Nhiều phương pháp được phát triển nhằm tinh sạch và xác định đặc tính của các peptide cĩ hoạt tính sinh học sau quá trình thủy phân. Đầu tiên, peptide sẽ được tách sơ bộ bằng các phương pháp như kết tủa, sắc ký loại trừ, siêu lọc hoặc tách pha rắn một cách cĩ chọn lọc. Sau đĩ được tinh sạch hồn tồn dựa trên sắc ký lọc gel hoặc sắc ký đảo pha (RP-HPLC). Và phương pháp xác định cấu trúc các loại peptide bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) [Leonli et al.,2000].
Phương pháp kết tủa
Kết tủa thường áp dụng cho các peptide hoặc protein cĩ kích thước lớn, sử dụng dung dịch hữu cơ (methanol, ethanol hoặc aceton) hay acid (acid trichloracetic), hoặc muối cĩ nồng độ cao (amoni sulphat) hoặc bằng cách điều chỉnh pH tới điểm đẳng điện.
Phương pháp màng siêu lọc là phương pháp đơn giản nhằm phân đoạn peptide dựa theo kích thước phân tử của chúng. Phương pháp lọc màng cĩ thuận lợi là sự phân bố khối lượng phân tử của những peptide cĩ tính năng mong muốn cĩ thể được kiểm sốt bằng cách dùng màng siêu lọc thích hợp. Phương pháp lọc màng an tồn, dễ dàng lắp đặt, bảo tồn được cấu trúc phân tử và địi hỏi năng lượng vừa phải. Ưu điểm chính của phương pháp lọc màng là làm cho sản phẩm cĩ tính đồng nhất cao thơng qua khả năng kiểm sốt được khối lượng phân tử của các phân đoạn peptide trong hydrolysate. Ngồi ra, để đạt được những peptide sinh học mong muốn cĩ thể dùng nhiều enzyme để thủy phân bằng cách dùng kết hợp hệ thống phản ứng với hệ thống lọc màng nhiều bước. Do vậy lọc màng là phương pháp triển vọng để sản xuất các peptide sinh học. Ngồi ra, nĩ cịn cĩ một số ứng dụng khác nữa là cải thiện giá trị cảm quan, làm trong hoặc loại màu và cơ đặc dịch thủy phân.
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học Năm 2012, He Ni, Lin Li và cộng sự đã cơng bố cơng trình nghiên cứu “Tách chiết và tinh sạch peptide ức chế ACE từ nấm men Sacharomyces cerevisiae”. Nhĩm tác giả đã Sử dụng ethanol 95%, thời gian 3 giờ, ở nhiệt độ 40o C để kết tủa acid nucleic và polysaccharide, sau đĩ ly tâm ở 11088 x g trong 15 phút, ở nhiệt độ 400C để loại bỏ tủa. Dịch sau khi kết tủa loại tạp sử dụng phương pháp siêu lọc để thu peptide ức chế ACE ở 3 phân đoạn với kích thước màng 100kDa, 30kDa, 10kDa. Thu được hexapeptide cĩ khả năng ức chế ACE.
Phương pháp sắc ký sắc ký lọc gel
Sắc ký lọc gel (hay cịn gọi là loại trừ kích thước) phân tách các peptide dựa theo kích thước và khối lượng phân tử, những chất cĩ khối lượng phân tử lớn đi len lỏi bên ngồi ra trước những chất cĩ khối lượng phân tử nhỏ chui qua lỗ gel ra sau, người ta thu các chất ở từng phân đoạn khác nhau. Ưu điểm của sắc ký lọc gel là điều kiện cĩ thể thay đổi thích hợp, tùy theo loại mẫu hoặc yêu cầu cụ thể cho các quá trình tinh sạch, phân tích và bảo quản sau này mà khơng làm ảnh hưởng đến quá trình phân tách. He Ni et al., 2012 đã sử dụng sắc ký lọc gel trên gel shephadex G-10 (15x400 mm, 50ml, GE healthcare, USD để phân tách peptide ức chế ACE từ nấm men. Tác giả Jian Fan et al., 2012 sử dụng sắc ký lọc gel trên gel shepadex G- 25 (Sigma Co.USD) để tách peptide chống oxy hĩa từ protein của cá rơ phi. Dịch thủy phân cá tráp biển được tinh sạch với sự kết hợp các phương pháp sắc ký lọc gel trên cột Shephadex LH-20 (Ammersham Pharmasia biotech, Tokyo), cột trao đổi ion thu được peptide cĩ hoạt tính sinh học cao nhất.
Phương pháp sắc ký đảo pha (RP-HPLC)
Sắc ký đảo pha dựa trên nguyên lý hydrophobicity- khơng ưa nước của các phân tử. Sự phân tách trong sắc ký ngược pha là dựa trên đặc điểm liên kết khác nhau của các chất tan cĩ mặt trong mẫu như là kết quả về sự khác biệt về tính kỵ nước của chúng. Các phân tử cĩ mức độ kỵ nước khác nhau như protein, peptide, acid nucleic phân tách được nhờ sắc ký ngược pha cĩ thể dễ dàng hồi tính và hịa tan trở lại. Pha động trong sắc ký đảo pha thường là các dung mơi phân cực cĩ thể
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học là nước, metanol, axetonitril… Tuy nhiên, người ta thường dùng hỗn hợp hai hay ba dung mơi để cĩ một pha động cĩ độ phân cực phù hợp với phép phân tích.