Hoạt tính chống oxy hĩa của dịch peptide cĩ thể được xác định thơng qua làm giảm màu của thuốc thử DPPH, được xác định bằng phép đo độ hấp thụ ở bước sĩng 517 nm trên máy quang phổ. Dung dịch DPPH được chuẩn bị với nồng độ 0,5 mM trong Ethanol (EtOH). CoQ10 được pha trong Ethanol 100% sao cho nồng độ cuối cùng đạt được một dãy các nồng độ 0,8; 0,4; 0,2; 0,1; 0,05, 0,025 mM. Thực hiện phản ứng với gốc tự do DPPH trong thời gian 30 phút ở 370C, đọc mật độ hấp thụ của DPPH chưa phản ứng bằng máy đọc Biotek ở bước sĩng 517 nm. Kết quả cho thấy với nồng độ peptide càng cao thì khả năng làm giảm màu thuốc thử càng lớn,
Hình 3.11. Phản ứng của dịch peptide làm giảm màu của thuốc thử DPPH với các nồng độ khác nhau (A:10µg/ml peptide, B: 20 µg/ml, C: 40 µg/ml, D: 60 µg/ml, E: 80 µg/ml)
Từ kết quả và hình ảnh 3.11, chúng tơi nhận thấy peptide được thủy phân từ bã nấm men bia cĩ khả năng chống oxi hĩa, ở nồng độ 10 µg/ml hoạt tính chưa thể hiện rõ, hoạt tính chống oxi hĩa tăng dần khi nồng độ tăng dần và làm màu của thuốc thử chuyển dần sang màu vàng. Với nồng độ 80 µg/ml, thuốc thử DPPH bị đổi màu mạnh nhất.
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học
Hình 3.12 Khả năng chống oxi hĩa của peptide
Hệ số chống oxi hĩa được xác định bằng cách bổ sung dịch peptide với các nồng độ khác nhau từ 10- 80 µg/ml vào dung dịch DPPH 0.5M, sau khi ủ ở 37oC trong 30 phút, đo lượng DPPH cịn lại và xác định hệ số EC50 là 62.4 µg/ml.
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Điều kiện tối ưu thủy phân giới hạn bã nấm men bia bằng chế phẩm protease Neutrase với nồng độ 5 % (290 U), nồng độ bã men bia 25%, nhiệt độ 50oC pH 6.5 với thời gian thủy phân 16h.
Đã xác định một số hoạt tính sinh học của peptide từ bã men bia: - Cĩ hoạt tính kìm hãm ACE với nồng độ từ 10-50 µg/ml ức chế từ
65.29% đến 72.85 % so với đối chứng là captoril. Giá trị IC50: 72.5 µg/ml.
- Cĩ khả năng ức chế một số vi khuẩn gây hại tại nồng độ 30 µg/ml: Với Salmolena Typhi 99.99 %, cịn với Listeria monocytogenes ức chế 86.61 % . Với Staphylococcus aureus ức chế 75.88 %.
- Cĩ hoạt tính chống oxi hĩa với giá trị EC50: 62.4 µg/ml.
KIẾN NGHỊ
- Tiếp tục nghiên cứu các hoạt tính sinh học khác của dịch thủy phân bã nấm men bia như hoạt tính chống ung thư, khả năng tăng cường sức đề kháng…. - Nghiên cứu ứng dụng bổ sung vào thực phẩm chức năng, và thuốc chống
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu tham khảo tiếng Việt
1. Nguyễn Thị Hồng Anh, Trịnh Vinh Hiển, Bùi Thị Thu Huyền, 2008. Chế biến nấm men từ phế phụ phẩm sản xuất bia làm nguyên liệu thức ăn chăn nuơi, Tạp chí Nơng nghiệp và Phát triển Nơng thơn, 16, 64 – 67.
2. Lại Thị Ngọc Hà, Vũ Thị Thư, 2009. Stress oxi hĩa và các chất chống oxi hĩa tự nhiên, Tạp chí Khoa học và phát triển 2009: Tập 7, số5: tr.667-677.
3. Trần Bích Lam, 2012. Tổng quan peptide cĩ hoạt tính sinh học, Đại học Bách Khoa Hồ Chí Minh.
4. Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tơ Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm 2003. Cơng nghệ enzym. NXB khoa học và kỹ thuật Hà Nội .
5. Hồ Xưởng, 1996. Cơng nghệ sản xuất bia. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
6. Trần Liên Hà, 2010. Nghiên cứu tổng hợp và thu nhận peptide chức năng kìm hãm enzyme chuyển angiotensine từ protein đậu tương, Viện Cơng nghệ sinh học và Cơng nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội.
II. Tài liệu tham khảo tiếng Anh
7. Alcaide-Hidalgo JM, Pueyo E, Polo MC, Martínez-Rodríguez AJ, 2007.
Bioactive peptides released from Saccharomyces cerevisiae under accelerated autolysis in a wine model system. J Food Sci. 72(7): pp 276-9
8. A. Quirós, B. Hernández-Ledesma, 2005. Angiotensin-Converting Enzyme Inhibitory Activity of Peptides Derived from Caprine Kefir. J. Dairy Sci, 88, pp.3480-3487.
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học 9. Anja Klančnik,Saša Piskernik, Barbara Jeršek, Sonja Smole Možina, 2010.
Evaluation of diffusion and dilution methods to determine the antibacterial activity of plant extracts. J Microbiol Methods. 2010 May;81(2):pp.121-6.
10. Bachere, E. , D., B., P., 2000.Penaeidins, antimicrobial peptides of shrimp: a comparison with other effectors of innate immunity. Aquaculture 191(2000):pp.71– 88.
11. Brij P. S., Shilpa V., Subrota H., 2014. Functional significance of bioactive peptides derived from soybean,Peptide .54, pp171-179
12. Bulet,P., Hetru, C., Dimarcq, J.L., Hoffmann, D.,1999. Antimicrobial peptides in insects; structure and function.Dev Comp Immunol.Jun-Jul;23(4-5):pp.329-44. 13. Chae HJ, Joo H, In MJ., (2001), Utilization of brewer's yeast cells for the production of food-grade yeast extract. Part 1: Effects of different enzymatic treatments on solid and protein recovery and flavor characteristics. Bioresource technology, 76, pp.253-258
14. Charajit Kaur and Harish C.Kapoor, 2001. Antioxidants in fruits and vegetables - the millennium's health. International Journal of Food Science and Technology 2001, 36, pp.703-725.
15. Chibuike C Udenigwe, 2014. Bioinformatics approaches, prospects and challenges of food bioactive peptide research. Trends in Food Science & Technology,36: pp 137–143.
16. Diane F. Birt, Suzanne Hendrich, Weiqun Wang, 2001. Dietary agents in cancer prevention: flavonoids and isoflavonoids. Pharmacology & Therapeutics, 90, pp.157-177.
17. Eunice A. Yamada ,Valdemiro C. Sgarbieri *, 2005.Yeast (Saccharomyces cerevisiae) Protein Concentrate: Preparation, Chemical Composition, and
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học
Nutritional and Functional Properties. J. Agric. Food Chem. , 53 (10), pp. 3931– 3936.
18. Eunice C Y, Li-Chan, 2015. Bioactive peptides and protein hydrolysates: research trends and challenges for application as nutraceuticals and functional food ingredients. Food Science 02/2015; 1:28-37
19. Frank C.C., Harold E. S., David H.P., George L.C., 1982. Spectrophotometric Assay Using o-Phthaldialdehyde for Determination of Proteolysis in Milk and Isolated Milk Proteins, Journal of Dairy Science, 66, pp.6.
20. Hasan Tanguler, Huseyin Erten, 2008. Utilisation of spent brewer's yeast for yeast extract production by autolysis: The effect of temperature. Food and bioproducts processing, 86, pp.317-321
21. Hazem M.M. Hassan, 2011. Antioxidant and Immunostimulanting Activities of Yeast ( Saccharomyces cerevisiae) Autolysates. World applied Sciences Journal, 15(8), pp.1110-1119.
22. I.M.P.L.V.O. Ferreira, O. Pinhoa, E. Vieiraa, J.G. Tavarelaa, 2010. Brewer's Saccharomyces yeast biomass: characteristics and potential applications. Trends in Food Science & Technology, 21(2), pp: 77–84
23. Jorge,A. Masso-Silva, Gill Diamond, 2014. Antimicrobial Peptides from Fish. Pharmaceuticals 7(3): pp.265-310
24. Korhonen H, Pihlanto A, 2006. Bioactive peptide: production and functionality. Int Dairy J, 16(9), pp.945-60.
25. Klancnik A1, Piskernik S, Jersek B, Mozina SS. 2010. Evaluation of diffusion and dilution methods to determine the antibacterial activity of plant extracts, J Microbiol Methods. 2010 May;81(2):pp 121-126.
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học
26. Mala, B.R., Aparna M.T., Mohini, S.G.,Vasanti, V. D, 1998. Molecular and Biotechnological Aspects of Microbial Proteases. Microbiol Mol Biol Rev.62(3): pp.597–635.
27. Man-Jin In, Dong Chung Kim, Hee Jeong Chae, 2005. Downstream process for the production of yeast extract using brewer's yeast cells, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 10, pp.85-90.
28. Nagpal R., Behare P., Rana R., Kumar A., Kumar M., Arora S., Morotta F., Jain S., Yadav H., 2011.Bioactive peptides derived from milk proteins and their health beneficial potentials. Food Funct, 2(1), pp.18-27.
29. Nielsen P.M., Petersen D. and Dambmann C., 2006. Improved Method for Determining Food Protein Degree of Hydrolysis, Journal of Food Science, 66, pp.5. 30. Nora Khaldi, 2012. Bioinformatics approaches for identifying new therapeutic bioactive peptides in food. Functional Foods in Health and Disease, 2(10), pp.325- 338.
31. Paula.J.P.E., Nilda.F.F.S., Jane.S.R.C., Nélio J.A., Renato S.C. and Eber.A.A.M., 2012. Bioactive Peptides: Synthesis, Properties, and Applications in the Packaging and Preservation of Food, Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 11.
32. Raikos V., Dassios T., 2014. Health-promoting properties of bioactive peptides derived from milk proteins in infant food, Dairy Sci Technol, 94, pp.91-101.
33. Reddy KVR, Yedery RD, Aranha C, 2004. Antimicrobial peptides: premises and promise. Ins J Antimicrob. Agents, 24 (6),pp.536-47.
33. Saito Koichiro et al, 2003. Antioxidative Properties of Tripeptide Libraries Prepared by the Combinatorial Chemistry. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 21, pp.3668-3674.
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học
34. Wiegand I1, Hilpert K, Hancock RE, 2008. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc. 2008;3(2):pp.163-75.
35. Yamada EA, Sgarbieri VC, 2005. Yeast (Saccharomyces cerevisiae) protein concentrate: preparation, chemical composition, and nutritional and functional properties. J Agric Food Chem. 2005 May 18;53(10):3931-6.
Website: 36. http://doan.edu.vn/do-an/luan-van-nghien-cuu-tan-dung-ba-men-bia-de-che- bien-men-chiet-xuat-dung-lam-thanh-phan-bo-sung-vao-moi-truong-nuoi-cay- 24108/ 37. http://123doc.org/document/193213-buoc-dau-nghien-cuu-tan-dung-ba-men- bia-de-san-xuat-nuoc-cham-len-men.htm 38. http://vast.ac.vn/1.0/index.php?option=com_detai&view=detai&id=494:khao- sat,-xac-dinh-mot-so-peptide-co-hoat-tinh-sinh-duoc-quy-tu-sinh-vat-bien-dac-huu- (oc-coi,-hai-mien)-bang-cac-ky-thuat-proteomics.&Itemid=54&lang=vi 39. http://baodatviet.vn/kinh-te/thi-truong/viet-nam-vao-top-5-nuoc-co-tieu-thu-bia- nhieu-nhat-3268299/ 40. http://kinhdoanh.vnexpress.net/tin-tuc/quoc-te/viet-nam-tro-thanh-diem-sang- tieu-thu-bia-trong-khu-vuc-3240206.html 41. http://www.sggp.org.vn/khoahoccongnghe/2007/12/137060/ 42.http://www.novozymes.com/en/solutions/biopharma/Brochures/Documents/2014 -12715-01_Biocatalysis-Product-Sheet-Protease-3.pdf
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học
Phụ lục
Phụ lục 1: Thí nghiệm xác định hoạt độ enzyme
Bước Mẫu thí nghiệm Mẫu kiểm chứng
1 2 ml dung dịch cơ chất casein 1% 2 ml dịch enzim
2 2 ml dịch enzim 4 ml TCA 0,3 M
3 Trộn đều
4 Để phản ứng trong đúng 10 phút ở nhiệt độ thích hợp
5 Dừng phản ứng bằng 4 ml TCA 0,3M 2 ml dung dịch cơ chất casein 1% 6 Khuấy trộn nhanh và để yên hỗn hợp trong 20 phút
7 Lọc, thu được dịch lọc thí nghiệm Lọc, thu được dịch lọc kiểm chứng
Bước Mẫu thí nghiệm Mẫu kiểm chứng
1 0,3 ml dịch lọc thí nghiệm 0,3 ml dịch lọc kiểm chứng
2 1,5 ml 0,5M Na2CO3
3 Trộn đều, để 10 phút
4 Thêm 0,3 ml dung dịch Folin, trộn đều
5 Để 20 phút
6 Đo A( =660nm) đối ngược với mẫu kiểm chứng
Phụ lục 2 : Hĩa chất Dung dịch OPA
- 8mg OPA hịa tan bằng 0,2ml Methanol
- 0,5ml SDS 20%
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học
- Định mức đến 10ml bằng nước cất
Phụ lục 3: Dựng đường chuẩn Peptone
- 0,1g peptone + 10ml H2O -> dung dịch Peptone 10mg/ml
- Từ dung dịch Peptone 10mg/ml tiến hành pha lỗng các nồng độ 2, 4, 6,8,10mg/ml theo bảng dưới đây
Dựng đường chuẩn Peptone
Nồng độ Peptone(mg/ml) 2 4 6 8 10 Dung dịch peptone 10mg/ml (µl) 10 20 30 40 50 H2O (µl) 40 30 20 10 0 Dung dịch OPA (µl) 200 200 200 200 200
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học
Phụ lục 3: Hĩa chất phương pháp Phân tích Peptide bằng điện di SDS-PAGE
Chuẩn bị đệm mẫu: Sử dụng nước khử ion, 0.5M Tris pH 6.8, glycerol, 20% SDS, Bromophenol Blue, β-mercaptoethanol
Thành phần gel phân tách (18%): H2O, Tris-HCl (pH 8.8), acrylamide 30%, SDS 10%, APS 10%, Temed
Thành phần Gel cơ (4%): H2O, Tris-HCl (pH6.8), acrylamide 30%, SDS 10%, APS 10%, Temed
Dung dịch nhuộm gel (DYE) gồm: Coomassie brilliant blue G250, methanol, acetic acid. Dung dịch tẩy m
àu gel: Methanol, acetic acid, H2O
Phụ lục 4 . Đồ thị đường chuẩn DPPH (mM)
DPPH
(mM) 0.0313 0.0625 0.125 0.25 0.5 1
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học
Phụ lục 5. Nồng độ peptide từ bã nấm men bia trung hịa gốc tự do DPPH
Tên mẫu Nồng độ phần trăm trung hịa gốc tự do DPPH (%) EC 50 (mM) Peptide cĩ hoạt tính sinh học µg/ml 0 10 20 40 60 80 100 62.5 µg/ml %DPPH cịn lại 100 89.3 77.1 65.72 55.4 40.21 12.98
Phụ lục 7: Kết quả đo OD hoạt tính ức chế ACE của peptide sau thủy phân
Nồng độ peptide A10 A30 Delta A Ac 10 Ac30 Delta Ac %ACE
10 0.416 0.293 0.123 0.769 0.316 0.453 72.85
20 0.457 0.321 0.136 0.453 69.98
30 0.517 0.359 0.158 0.453 65.12
40 0.597 0.421 0.176 0.453 61.15
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học Phụ lục 8: Thành phần mơi trường LB Thành phần Hàm lượng Trypton 10 g NaCl 10 g Cao nấm men 5 g Nước cất vừa đủ 1000 ml Agar 9g