2.2.1. ... T hủy phân bã nấm men bia và tinh sạch peptide[13,20]
Bã nấm men bia được lấy từ bồn chứa của nhà máy bia, rửa với nước lạnh 4oC, để lắng 30 phút, ly tâm loại nước 10000 vịng trong 10 phút ở 4oC. Quy trình lặp lại 3 lần, thu được bã nấm men nguyên liệu thủy phân.
Quá trình thủy phân:
Bã men bia sau tiền xử lý, đun ở 95oC trong 5 phút để diệt men. Sau đĩ đưa về pH 6,5 bằng NaOH 1M. Tiến hành khảo sát các yếu tố thủy phân bằng protease (nồng độ enzyme, cơ chất, pH, nhiệt độ, thời gian). Dịch sau thủy phân được đun ở 90oC trong 5 phút để bất hoạt enzyme, ly tâm 12000 vịng/phút, 4oC trong 20 phút, thu dịch nổi và tinh sạch.
Tinh sạch qua màng cross-flow 10Kda
Dịch sau thủy phân được ly tâm ở tốc độ cao 12000 vịng/ phút trong 20 phút tiếp tục lấy dịch lọc bằng thiết bị lọc chân khơng. Sau đĩ lọc bằng thiết bị lọc dịng ngang kích thước cột lọc 10KDa. Áp suất vào 8psi, áp suất ra 10 psi, tốc độ bơm 35 ml/phút ở điều kiện nhiệt độ phịng. Giữ lại phần dịch đi qua màng để phân tích kết quả. Đối với dịch thủy phân lượng nhỏ, sử dụng màng lọc cutoff 10KDa của Milipore để lọc thay thế thiết bị lọc dịng ngang.
2.2.2. Phương pháp điện di trên gel Polyacrylamide (SDS- PAGE) [6]
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học Tiến hành : mẫu sau khi được biến tính với Dye 4X, dùng micropipet hút 20µl mẫu/ giếng gel, với mẫu chuẩn (marker) 5 µl/ giếng. Điện áp cài đặt 70V, cường độ 30A. Sau khi mẫu chạy xuống mép dưới của bản kính, tiến hành tháo cắt bỏ phần gel cơ bên trên, nhuộm gel và tẩy màu gel với dung dịch pha sẵn cho đến khi bản gel sáng màu, chụp ảnh gel, đọc kết quả và lưu gel trong túi nhựa hàn kín bảo quản trong tủ 4oC.
2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng peptide tổng OPA [6,19,30]
Mục đích: Xác định tổng hàm lượng peptide cĩ trong các mẫu thủy phân, mẫu cĩ hàm lượng peptide càng cao chứng tỏ khả năng thủy phân protein bã nấm men càng lớn, khả năng thu được các peptide cĩ hoạt tính sinh học càng cao.
Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng giữa các amino axit trong phân tử protein kết hợp với hỗn hợp chất chỉ thị OPA (Ortho-Phthaldehyde) tạo ra một phức chất cĩ khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh ở bước sĩng 340 nm. Dựa vào đường chuẩn pepton ta tính được hàm lượng peptide tổng trong dịch thủy phân.
Tiến hành: Pha dung dịch hĩa chất OPA gồm cĩ 40 mg OPA trong 1ml methanol, bổ sung 2,5 ml SDS 20%, 100 µl β- Mercaptoethanol, pH 7.0, 25 ml đệm Natriteraborat (Na2B4O7.10H2O) định mức tới 50 ml bằng nước cất. Để đo mẫu, lấy 50 µl và 200 µl dung dịch OPA vào đĩa 96 giếng, trộn đều hỗn hợp 5 giây, để yên 2 phút rồi đo quang ở bước sĩng 340nm. Kết quả được tính dựa vào đường chuẩn peptone.
2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm ACE [6, 8]
Mục đích: Xác định hoạt tính kìm hãm ACE của dịch thủy phân, mẫu cĩ khả năng kìm hãm lớn thì khả năng chống tăng huyết áp cao hơn.
Nguyên tắc: sử dụng cơ chất là FAPGG (N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Phe-Gly- Gly) enzyme ACE sẽ xúc tác thủy phân FAPGG thành các axit amin như sơ đồ sau FAPGG ACE FAP + Gly – Gly
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học FAPGG hấp thụ mạnh ở bước sĩng 340 nm. Dưới tác dụng của ACE, FAPGG bị thủy phân và khả năng hấp thụ ở bước sĩng 340 nm giảm. Hoạt tính của enzym ACE được xác định dựa trên mức độ giảm độ hấp thụ ánh sáng đĩ.
Tiến hành theo phương pháp của Wen-chi Hou và cộng sự (2003), 0.0159g FAPGG pha trong đệm 50mM Tris-HCl pH 8,2 đạt nồng độ 2mM, ACE pha với nước cất đạt nồng độ 50 mM. Captoril: viên của dược phẩm Stada Việt Nam, nghiền nhỏ, bổ sung 1ml nước cất, ly tâm loại cặn, thu dịch, pha lỗng tới nồng độ captoril 25 µg/ml làm mẫu đối chứng. Thành phần phản ứng như bảng sau.
Thành phần Mẫu đo hoạt tính ACE (µl)
Mẫu đối chứng (µl)
ACE 50 mM 10 10
Dịch thủy phân cĩ chứa
peptide 10 -
Captoril 25mg/ml - 10
FAPGG 150 150
Hỗn hợp phản ứng được để trong 30 phút ở nhiệt độ 37oC, đo lần một sau 10 phút và lần hai sau 30 phút bằng thiết bị nanodrop ở bước sĩng 340 nm
Độ giảm sự hấp thụ được tính tốn như sau : A= A10 phút – A30 phút
Hoạt tính kìm hãm ACE % được tính tốn:
ACEinhibitory (%)= [ 1- ( Ainhibitor - Acontrol) ] x 100 %
2.2.5. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hĩa DPPH [14,37]
Nguyên tắc: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là gốc tự do được dùng để sàng lọc tác dụng chống oxy hĩa của các chất nghiên cứu. Hoạt tính chống oxy hĩa
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
thể hiện qua việc làm giảm màu DPPH của chất thử, được xác định bằng phép đo độ hấp thụ ở bước sĩng 517 nm trên máy quang phổ.
Tiến hành: theo phương pháp của Hwee- Leng Siow và cộng sự (2013) cĩ sửa đổi, dung dịch DPPH được chuẩn bị với nồng độ 0,5 mM trong Ethanol (EtOH), mẫu phân tích được lấy từ 10 µl các nống độ peptide khác nhau với 190 µl DPPH 0.5M, tổng thể tích mẫu phân tích là 200 µl.
Hỗn hợp được để ở nhiệt độ 37oC, đọc kết quả phản ứng giữa mẫu dịch thủy phân và dung dịch DPPH bằng máy đọc Biotek ở bước sĩng 517 nm.
Hoạt tính chống oxi hĩa so với acid ascobic được tính theo cơng thức: %DPPH = (Acontrol – Asample)/ Acontrol x 100%
Trong đĩ:
Acontrol : độ hấp thụ quang của mẫu acid ascobic
Asample : độ hấp thụ quang của mẫu dịch thủy phân tại thời điểm 30 phút
2.2.5. Xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp đếm khuẩn lạc [25]
Mục đích: Xác định số khuẩn lạc mọc trên mơi trường nuơi cấy cĩ bổ sung dịch thủy phân.
Tiến hành: Ba chủng vi khuẩn được tiến hành làm thí nghiệm là Salmolena Typhi, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus. Chủng giống từ tủ bảo quản được nuơi cấy trong mơi trường LB lỏng (2ml LB+ 200 mcrolit dịch khuẩn). Sau 10-12h, đo mật độ vi khuẩn lần 1, hút 100 microlit dịch khuẩn vào 2ml mơi trường cĩ bổ sung dịch peptide với các nồng độ khác nhau (10-20-30 µg/ml). Nuơi cấy lắc ở nhiệt độ 37, trong 24h. Pha lỗng dịch khuẩn nuơi cấy ở các hệ số từ 102 - 106 (0.1 mL 105 - 106 CFU/mL, hút 100 microlit trang trên đĩa thạch LB, nuơi cấy trong 24h, quan sát kết quả so với mẫu đối chứng đĩa thạch cĩ cùng nồng độ vi khuẩn và khơng chứa dịch thủy phân.
2.2.7. Tối ưu hĩa quá trình thủy phân bã nấm men bia theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm bậc hai Box-Benken sử dụng phần mềm Design Expert 7.1.5 hoạch thực nghiệm bậc hai Box-Benken sử dụng phần mềm Design Expert 7.1.5 (State-Ease, Inc., Minneapolis, Mỹ).
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học
Bước 1. Xây dựng mơ hình tốn học dạng y= b0 + b1X1 + b11 X1 2 + b2 X2 + b22 X2 2 + b3X3+ b33X32 + b12 X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3 Trong đĩ : Y: hàm mục tiêu Xi : Các biến mã số (chỉ nhận các giá trị -1, 0. +1)
bi : các hệ số diễn tả mức độ ảnh hưởng của các biến Xi đến hàm mục tiêu. Xác định các biến ảnh hưởng, các mức và khoảng thay đổi của từng biến từ khảo sát thực nghiệm và tham khảo các tài liệu đã cơng bố (chi tiết phụ lục 4)
Lập ma trận thực nghiệm theo Box-Benken: gồm 17 thí nghiệm kết hợp các yếu tố với 3 mức +1 ( mức cao nhất ), -1 ( mức thấp nhất ) và 0 ( mức trung bình ), trong đĩ cĩ 5 thí nghiệm lặp ở tâm ( các yếu tố đều ở mức 0 )
Tiến hành thực nghiệm: thủy phân bã nấm men bia ở các nồng độ khác nhau15; 20; 25 % bằng enzyme Neutral 3; 4; 5 % ở pH 6.0; 6.5; 7.0 với nhiệt độ 50oC, thời gian 16h. Kết thúc quá trình thủy phân, đun cách thủy dịch ở nhiệt độ 95
oC trong 5 phút để bất hoạt enzyme. Dịch thủy phân được ly tâm 12000 vịng/phút nhiệt độ 4oC thời gian10 phút. Dịch nổi được lọc qua màng siêu lọc 10 kDa. Lấy dịch đã qua màng để xác định hàm lượng peptide bằng phương pháp OPA
Tính tốn hệ số của hàm hồi quy
Kiểm tra độ phù hợp của mơ hình và ý nghĩa của các hệ số hồi quy Đánh giá sự sai lệch giữa mơ hình và thực nghiệm theo chuẩn Fisher
Bước 2: Cực đại hĩa hàm mục tiêu theo phương pháp hàm kỳ vọng
Biến số Yếu tố Đơn vị Mức -1 Mức
+1 X1 Nồng độ Enzyme %(w/w) 3 5 X2 Nồng độ cơ chất %(w/v) 15 25 X3 pH 6 7
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu lựa chọn enzyme thủy phân
Bã nấm men bia sau tiền xử lý tiến hành thủy phân bã nấm men bia với 3 chế phẩm enzyme Alcalase 260 UI/g, Flavouzym 280 UI/g, Neutrase 290 UI/g của Novozyme ở các điều kiện chung về nồng độ enzyme 232 U (4%) , nồng độ cơ chất 20%, thời gian thủy phân 16h, nhiệt độ 50oC đối với Flavouzym và Neutrase, 55oC với Alcalase. pH 6.5 đối với Flavouzym và Neutrase, pH 8 đối với Alcalase. Kết thúc quá trình, dịch thủy phân được gia nhiệt 95oC trong 5 phút để bất hoạt enzym, tiến hành ly tâm 12000 vịng/ phút trong 20 phút nhiệt độ 4oC. Loại bỏ bã thu dịch nổi lọc qua màng siêu lọc 10Kda. Xác định hoạt tính kìm hãm ACE của dịch peptide được thủy phân bởi 3 chế phẩm Enzym. Kết quả được biểu diễn ở bảng 3.1
Enzym Hoạt tính kìm
hãm ACE (%)
Alcalase 57.6
Flavouzym 54.3 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Neutrase 56.2
Bảng 3.1. Kết quả lựa chọn enzym thủy phân
Từ kết quả cho thấy, dịch peptide thủy phân bởi chế phẩm Alcalase cho hoạt tính ức chế ACE cao nhất 57,6% sau đĩ tới chế phẩm Neutrase 56,2% và chế phẩm Flavouzym 54,3% . Tuy nhiên, chúng tơi chọn enzym Neutrase cho các nghiên cứu tiếp theo do bản chất là một endopeptide, phù hợp cho quá trình sản xuất peptide Neutrase cĩ khả năng thủy phân bã nấm men bia thành peptide cao hơn 2 loại enzym cịn lại. Mặt khác Neutrase bản chất là protease trung tính nên việc điều chỉnh pH trước quá trình thủy phân đơn giản hơn, khơng tốn kém hĩa chất trung hịa nguyên liệu pH của bã nấm men thường từ 6.5- 7.0, trong khi đĩ pH của
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học
Alcalase là 8, nếu sử dụng enzym này sẽ phải sử dụng hĩa chất để điều chỉnh gây tốn kém hĩa chất, giá thành tăng.
3.2. Khảo sát nồng độ enzym
Bã nấm men sau tiền xử lý tiến hành thủy phân giới hạn với nồng độ cơ chất 20%, ở nhiệt độ 50oC, pH 7, thời gian 16h với các nồng độ enzyme 2, 3, 4, 5 và 6%. Tương ứng với 116; 174; 232; 290; 348 U. Dịch sau khi thủy phân được lọc qua màng 10 KDa. Xác định hàm lượng peptide tổng theo phương pháp OPA và điện di. Kết quả hàm lượng peptide được biểu diễn ở biểu đồ và điện di đồ dưới đây.
Hình 3.1. (A) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến khả năng tạo peptide sinh học. (B) Điện di đồ sản phẩm thủy phân ở các nồng độ E/S khác nhau
Từ hình 3.1A và 3.1B cho thấy, nếu tăng tỉ lệ enzyme trong quá trình thủy phân bã men bia thì hàm lượng peptide cĩ khối lượng phân tử < 10 Kda thu được cũng tăng lên. Tuy nhiên từ nồng độ enzyme 4-6% tương ứng (116-348 U) thì khi tăng nồng độ enzyme lượng peptide tăng khơng đáng kể, cĩ thể với thời gian cố định thì sản phẩm tạo ra đã ở mức bão hịa, quá trình thủy phân gần như ổn định. Vì vậy chúng tơi chọn nồng độ enzyme 4% (232 UI)
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học
Tiến hành thủy phân với các nồng độ bã nấm men bia khác nhau 15, 20 và 25% (w/v) ở các điều kiện cố định: nồng độ enzyme 4% (232 U), pH 6,5; 50oC; 16h. Hàm lượng peptide được thể hiện ở hình 3.3A và 3.3B.
Hình 3.2.(A) Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất tới khả năng tạo peptide. (B) Điện di đồ sản phẩm peptide ở điều kiện nồng độ cơ chất khác nhau
Kết quả hình 3.2 A và 3.2 B cho ta thấy khi nồng độ cơ chất tăng trong khoảng 15-25% thì hàm lượng peptide cũng tăng. Tuy nhiên tại nồng độ bã nấm men bia là 20% và 25%, hàm lượng peptide tăng khơng đáng kể. Vì vậy, chúng tơi chọn nồng độ cơ chất từ 20% đến 25%. Nhiều tài liệu đã cơng bố các peptide cĩ khối lượng phân tử thấp <10 KDa cho hoạt tính sinh học. Tuy nhiên, tùy peptide cĩ khối lượng phân tử khác nhau <10Kda, <5 KDa, <3 KDa mức độ các hoạt tính sinh học khác nhau, nhưng do thời gian cĩ hạn, bước đầu chúng tơi chỉ tiến hành khảo sát các điều kiện thủy phân để tạo các peptide cĩ hoạt tính sinh học < 10KDa
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học
Sau khi chọn được nồng độ enzyme, chúng tơi tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của pH với dải pH là 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 và 8,0 với các điều kiện enzyme 4% (232 U), cơ chất 20%, ở 50oC, 16h. Xác định hàm lượng peptide của dịch thủy phân, kết quả biểu diễn tại hình dưới
Hình 3.3. (A) Ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo peptide.(B) Điện di đồ của sản phẩm thủy phân ở các điểm pH khác nhau
Kết quả hình 3.3(A), (B) cho thấy trong dải pH từ 6,0 đến 7,0 hàm lượng peptide thu được tương đối tốt từ 182-192 mg/g và đạt giá trị cao nhất tại pH 6,5 (192 mg/g bã nấm men ), cũng được thể hiện ở ảnh điện di đồ xuất hiện băng đậm nhất. Điều này là hợp lý vì chế phẩm Neutrase bản chất là protease trung tính, hoạt động mạnh ở pH 5,5 - 7,0 [44]. Do vậy, chúng tơi chọn pH thích hợp để thủy phân bã men bia tạo peptide là 6,5.
3.5. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình thủy phân
Sau khi chọn được nồng độ enzyme 4% (232 U), pH 6,5, chúng tơi tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tạo peptide cĩ kích thước nhỏ hơn 10kDa với dải nhiệt độ là 40, 45, 50, 55, và 60oC.Với cơ chất 20%, thời gian 16h. Kết quả hàm lượng peptide được biểu diễn tại hình 3.4 A và hình 3.4 B
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học
Hình 3.4. (A) Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tạo peptide, (B) Điện di đồ sản phẩm peptide ở điều kiện nhiệt độ khác nhau
Kết quả từ hình 3.4A và 3.4B cho thấy khi nhiệt độ thủy phân tăng từ 40oC đến 50oC, thì hàm lượng peptide thu được tăng lên và đạt giá trị cao nhất là 192,8 mg/g tại 50oC. Tiếp tục tăng nhiệt độ thủy phân hàm lượng peptide giảm dần cĩ thể do nhiệt độ cao làm ức chế hoạt động của Enzym. Kết quả này phù hợp với cơng bố của Hasan Tanguler và Huseyin Erten (2008). Điều này cũng phù hợp với khuyến cáo của nhà sản xuất về nhiệt độ tối ưu của chế phẩm Neutrase là 45-55oC.
3.6. Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình thủy phân bã nấm men bia
Trong thực tế sản xuất, thời gian là một yếu tố quan trọng khơng những liên quan đến hiệu suất thủy phân mà cịn ảnh hưởng đến chi phí năng lượng của quá trình và năng suất hoạt động của thiết bị thủy phân.
Sau khi chọn được các yếu tố thủy phân tối ưu trên, chúng tơi tiếp tục khảo sát thời gian thủy phân 12h; 14h; 16h; 18h; 20h. Với cơ chất 20%, enzyme 4% (232 U) nhiệt độ 50oC, pH 6,5. Kết quả điện di và hàm lượng peptide theo phương pháp OPA thu được như hình 3.6A và 3.6B
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học
Hình 3.5. (A) Ảnh hưởng của thời gian khả năng tạo peptide và Điện di đồ sản phẩm peptide ở thời điểm thủy phân khác nhau
Từ kết quả trên hình 3.54A và 3.5B, cho thấy thời gian thủy phân càng dài thì hàm lượng peptide càng cao và tại 20h thủy phân, đạt giá trị cực đại 198,45 mg/g. Tương ứng ảnh điện di đồ ở thời điểm 20h cũng xuất hiện băng đậm nhất. Tuy nhiên,trong khoảng thời gian thủy phân từ 16-20 h thì hàm lượng peptide tăng khơng nhiều (193,5-198,45 mg/g) nên chúng tơi chọn thời gian thủy phân là 16h. Khi đĩ hàm lượng peptide thu được là 193,5 mg/g nhằm tiết kiệm thời gian và chi