Nguyên tắc: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là gốc tự do được dùng để sàng lọc tác dụng chống oxy hĩa của các chất nghiên cứu. Hoạt tính chống oxy hĩa
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học
thể hiện qua việc làm giảm màu DPPH của chất thử, được xác định bằng phép đo độ hấp thụ ở bước sĩng 517 nm trên máy quang phổ.
Tiến hành: theo phương pháp của Hwee- Leng Siow và cộng sự (2013) cĩ sửa đổi, dung dịch DPPH được chuẩn bị với nồng độ 0,5 mM trong Ethanol (EtOH), mẫu phân tích được lấy từ 10 µl các nống độ peptide khác nhau với 190 µl DPPH 0.5M, tổng thể tích mẫu phân tích là 200 µl.
Hỗn hợp được để ở nhiệt độ 37oC, đọc kết quả phản ứng giữa mẫu dịch thủy phân và dung dịch DPPH bằng máy đọc Biotek ở bước sĩng 517 nm.
Hoạt tính chống oxi hĩa so với acid ascobic được tính theo cơng thức: %DPPH = (Acontrol – Asample)/ Acontrol x 100%
Trong đĩ:
Acontrol : độ hấp thụ quang của mẫu acid ascobic
Asample : độ hấp thụ quang của mẫu dịch thủy phân tại thời điểm 30 phút
2.2.5. Xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp đếm khuẩn lạc [25]
Mục đích: Xác định số khuẩn lạc mọc trên mơi trường nuơi cấy cĩ bổ sung dịch thủy phân.
Tiến hành: Ba chủng vi khuẩn được tiến hành làm thí nghiệm là Salmolena Typhi, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus. Chủng giống từ tủ bảo quản được nuơi cấy trong mơi trường LB lỏng (2ml LB+ 200 mcrolit dịch khuẩn). Sau 10-12h, đo mật độ vi khuẩn lần 1, hút 100 microlit dịch khuẩn vào 2ml mơi trường cĩ bổ sung dịch peptide với các nồng độ khác nhau (10-20-30 µg/ml). Nuơi cấy lắc ở nhiệt độ 37, trong 24h. Pha lỗng dịch khuẩn nuơi cấy ở các hệ số từ 102 - 106 (0.1 mL 105 - 106 CFU/mL, hút 100 microlit trang trên đĩa thạch LB, nuơi cấy trong 24h, quan sát kết quả so với mẫu đối chứng đĩa thạch cĩ cùng nồng độ vi khuẩn và khơng chứa dịch thủy phân.
2.2.7. Tối ưu hĩa quá trình thủy phân bã nấm men bia theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm bậc hai Box-Benken sử dụng phần mềm Design Expert 7.1.5 hoạch thực nghiệm bậc hai Box-Benken sử dụng phần mềm Design Expert 7.1.5 (State-Ease, Inc., Minneapolis, Mỹ).
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học
Bước 1. Xây dựng mơ hình tốn học dạng y= b0 + b1X1 + b11 X1 2 + b2 X2 + b22 X2 2 + b3X3+ b33X32 + b12 X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3 Trong đĩ : Y: hàm mục tiêu Xi : Các biến mã số (chỉ nhận các giá trị -1, 0. +1)
bi : các hệ số diễn tả mức độ ảnh hưởng của các biến Xi đến hàm mục tiêu. Xác định các biến ảnh hưởng, các mức và khoảng thay đổi của từng biến từ khảo sát thực nghiệm và tham khảo các tài liệu đã cơng bố (chi tiết phụ lục 4)
Lập ma trận thực nghiệm theo Box-Benken: gồm 17 thí nghiệm kết hợp các yếu tố với 3 mức +1 ( mức cao nhất ), -1 ( mức thấp nhất ) và 0 ( mức trung bình ), trong đĩ cĩ 5 thí nghiệm lặp ở tâm ( các yếu tố đều ở mức 0 )
Tiến hành thực nghiệm: thủy phân bã nấm men bia ở các nồng độ khác nhau15; 20; 25 % bằng enzyme Neutral 3; 4; 5 % ở pH 6.0; 6.5; 7.0 với nhiệt độ 50oC, thời gian 16h. Kết thúc quá trình thủy phân, đun cách thủy dịch ở nhiệt độ 95
oC trong 5 phút để bất hoạt enzyme. Dịch thủy phân được ly tâm 12000 vịng/phút nhiệt độ 4oC thời gian10 phút. Dịch nổi được lọc qua màng siêu lọc 10 kDa. Lấy dịch đã qua màng để xác định hàm lượng peptide bằng phương pháp OPA
Tính tốn hệ số của hàm hồi quy
Kiểm tra độ phù hợp của mơ hình và ý nghĩa của các hệ số hồi quy Đánh giá sự sai lệch giữa mơ hình và thực nghiệm theo chuẩn Fisher
Bước 2: Cực đại hĩa hàm mục tiêu theo phương pháp hàm kỳ vọng
Biến số Yếu tố Đơn vị Mức -1 Mức
+1 X1 Nồng độ Enzyme %(w/w) 3 5 X2 Nồng độ cơ chất %(w/v) 15 25 X3 pH 6 7
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu lựa chọn enzyme thủy phân
Bã nấm men bia sau tiền xử lý tiến hành thủy phân bã nấm men bia với 3 chế phẩm enzyme Alcalase 260 UI/g, Flavouzym 280 UI/g, Neutrase 290 UI/g của Novozyme ở các điều kiện chung về nồng độ enzyme 232 U (4%) , nồng độ cơ chất 20%, thời gian thủy phân 16h, nhiệt độ 50oC đối với Flavouzym và Neutrase, 55oC với Alcalase. pH 6.5 đối với Flavouzym và Neutrase, pH 8 đối với Alcalase. Kết thúc quá trình, dịch thủy phân được gia nhiệt 95oC trong 5 phút để bất hoạt enzym, tiến hành ly tâm 12000 vịng/ phút trong 20 phút nhiệt độ 4oC. Loại bỏ bã thu dịch nổi lọc qua màng siêu lọc 10Kda. Xác định hoạt tính kìm hãm ACE của dịch peptide được thủy phân bởi 3 chế phẩm Enzym. Kết quả được biểu diễn ở bảng 3.1
Enzym Hoạt tính kìm
hãm ACE (%)
Alcalase 57.6
Flavouzym 54.3
Neutrase 56.2
Bảng 3.1. Kết quả lựa chọn enzym thủy phân
Từ kết quả cho thấy, dịch peptide thủy phân bởi chế phẩm Alcalase cho hoạt tính ức chế ACE cao nhất 57,6% sau đĩ tới chế phẩm Neutrase 56,2% và chế phẩm Flavouzym 54,3% . Tuy nhiên, chúng tơi chọn enzym Neutrase cho các nghiên cứu tiếp theo do bản chất là một endopeptide, phù hợp cho quá trình sản xuất peptide Neutrase cĩ khả năng thủy phân bã nấm men bia thành peptide cao hơn 2 loại enzym cịn lại. Mặt khác Neutrase bản chất là protease trung tính nên việc điều chỉnh pH trước quá trình thủy phân đơn giản hơn, khơng tốn kém hĩa chất trung hịa nguyên liệu pH của bã nấm men thường từ 6.5- 7.0, trong khi đĩ pH của
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học
Alcalase là 8, nếu sử dụng enzym này sẽ phải sử dụng hĩa chất để điều chỉnh gây tốn kém hĩa chất, giá thành tăng.
3.2. Khảo sát nồng độ enzym
Bã nấm men sau tiền xử lý tiến hành thủy phân giới hạn với nồng độ cơ chất 20%, ở nhiệt độ 50oC, pH 7, thời gian 16h với các nồng độ enzyme 2, 3, 4, 5 và 6%. Tương ứng với 116; 174; 232; 290; 348 U. Dịch sau khi thủy phân được lọc qua màng 10 KDa. Xác định hàm lượng peptide tổng theo phương pháp OPA và điện di. Kết quả hàm lượng peptide được biểu diễn ở biểu đồ và điện di đồ dưới đây.
Hình 3.1. (A) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến khả năng tạo peptide sinh học. (B) Điện di đồ sản phẩm thủy phân ở các nồng độ E/S khác nhau
Từ hình 3.1A và 3.1B cho thấy, nếu tăng tỉ lệ enzyme trong quá trình thủy phân bã men bia thì hàm lượng peptide cĩ khối lượng phân tử < 10 Kda thu được cũng tăng lên. Tuy nhiên từ nồng độ enzyme 4-6% tương ứng (116-348 U) thì khi tăng nồng độ enzyme lượng peptide tăng khơng đáng kể, cĩ thể với thời gian cố định thì sản phẩm tạo ra đã ở mức bão hịa, quá trình thủy phân gần như ổn định. Vì vậy chúng tơi chọn nồng độ enzyme 4% (232 UI)
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học
Tiến hành thủy phân với các nồng độ bã nấm men bia khác nhau 15, 20 và 25% (w/v) ở các điều kiện cố định: nồng độ enzyme 4% (232 U), pH 6,5; 50oC; 16h. Hàm lượng peptide được thể hiện ở hình 3.3A và 3.3B.
Hình 3.2.(A) Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất tới khả năng tạo peptide. (B) Điện di đồ sản phẩm peptide ở điều kiện nồng độ cơ chất khác nhau
Kết quả hình 3.2 A và 3.2 B cho ta thấy khi nồng độ cơ chất tăng trong khoảng 15-25% thì hàm lượng peptide cũng tăng. Tuy nhiên tại nồng độ bã nấm men bia là 20% và 25%, hàm lượng peptide tăng khơng đáng kể. Vì vậy, chúng tơi chọn nồng độ cơ chất từ 20% đến 25%. Nhiều tài liệu đã cơng bố các peptide cĩ khối lượng phân tử thấp <10 KDa cho hoạt tính sinh học. Tuy nhiên, tùy peptide cĩ khối lượng phân tử khác nhau <10Kda, <5 KDa, <3 KDa mức độ các hoạt tính sinh học khác nhau, nhưng do thời gian cĩ hạn, bước đầu chúng tơi chỉ tiến hành khảo sát các điều kiện thủy phân để tạo các peptide cĩ hoạt tính sinh học < 10KDa
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học
Sau khi chọn được nồng độ enzyme, chúng tơi tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của pH với dải pH là 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 và 8,0 với các điều kiện enzyme 4% (232 U), cơ chất 20%, ở 50oC, 16h. Xác định hàm lượng peptide của dịch thủy phân, kết quả biểu diễn tại hình dưới
Hình 3.3. (A) Ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo peptide.(B) Điện di đồ của sản phẩm thủy phân ở các điểm pH khác nhau
Kết quả hình 3.3(A), (B) cho thấy trong dải pH từ 6,0 đến 7,0 hàm lượng peptide thu được tương đối tốt từ 182-192 mg/g và đạt giá trị cao nhất tại pH 6,5 (192 mg/g bã nấm men ), cũng được thể hiện ở ảnh điện di đồ xuất hiện băng đậm nhất. Điều này là hợp lý vì chế phẩm Neutrase bản chất là protease trung tính, hoạt động mạnh ở pH 5,5 - 7,0 [44]. Do vậy, chúng tơi chọn pH thích hợp để thủy phân bã men bia tạo peptide là 6,5.
3.5. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình thủy phân
Sau khi chọn được nồng độ enzyme 4% (232 U), pH 6,5, chúng tơi tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tạo peptide cĩ kích thước nhỏ hơn 10kDa với dải nhiệt độ là 40, 45, 50, 55, và 60oC.Với cơ chất 20%, thời gian 16h. Kết quả hàm lượng peptide được biểu diễn tại hình 3.4 A và hình 3.4 B
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học
Hình 3.4. (A) Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tạo peptide, (B) Điện di đồ sản phẩm peptide ở điều kiện nhiệt độ khác nhau
Kết quả từ hình 3.4A và 3.4B cho thấy khi nhiệt độ thủy phân tăng từ 40oC đến 50oC, thì hàm lượng peptide thu được tăng lên và đạt giá trị cao nhất là 192,8 mg/g tại 50oC. Tiếp tục tăng nhiệt độ thủy phân hàm lượng peptide giảm dần cĩ thể do nhiệt độ cao làm ức chế hoạt động của Enzym. Kết quả này phù hợp với cơng bố của Hasan Tanguler và Huseyin Erten (2008). Điều này cũng phù hợp với khuyến cáo của nhà sản xuất về nhiệt độ tối ưu của chế phẩm Neutrase là 45-55oC.
3.6. Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình thủy phân bã nấm men bia
Trong thực tế sản xuất, thời gian là một yếu tố quan trọng khơng những liên quan đến hiệu suất thủy phân mà cịn ảnh hưởng đến chi phí năng lượng của quá trình và năng suất hoạt động của thiết bị thủy phân.
Sau khi chọn được các yếu tố thủy phân tối ưu trên, chúng tơi tiếp tục khảo sát thời gian thủy phân 12h; 14h; 16h; 18h; 20h. Với cơ chất 20%, enzyme 4% (232 U) nhiệt độ 50oC, pH 6,5. Kết quả điện di và hàm lượng peptide theo phương pháp OPA thu được như hình 3.6A và 3.6B
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học
Hình 3.5. (A) Ảnh hưởng của thời gian khả năng tạo peptide và Điện di đồ sản phẩm peptide ở thời điểm thủy phân khác nhau
Từ kết quả trên hình 3.54A và 3.5B, cho thấy thời gian thủy phân càng dài thì hàm lượng peptide càng cao và tại 20h thủy phân, đạt giá trị cực đại 198,45 mg/g. Tương ứng ảnh điện di đồ ở thời điểm 20h cũng xuất hiện băng đậm nhất. Tuy nhiên,trong khoảng thời gian thủy phân từ 16-20 h thì hàm lượng peptide tăng khơng nhiều (193,5-198,45 mg/g) nên chúng tơi chọn thời gian thủy phân là 16h. Khi đĩ hàm lượng peptide thu được là 193,5 mg/g nhằm tiết kiệm thời gian và chi phí năng lượng cho quá trình thủy phân.
3.7. Tối ưu hĩa các điều kiện thủy phân bã nấm men bia theo phương pháp quy hoạch bậc 2 Box-Behnken sử dụng phần mềm Design Expert 7.1.5 quy hoạch bậc 2 Box-Behnken sử dụng phần mềm Design Expert 7.1.5
Dựa trên cơ sở đã khảo sát điều kiện thích hợp tạo peptide cĩ hoạt tính sinh học ở các yếu tố ảnh hưởng đơn: nồng độ enzyme, pH, nhiệt độ, nồng độ cơ chất, thời gian. Nhận thấy để đạt được hiệu quả thủy phân thu peptide sinh học cao, chúng tơi tiến hành xác định ảnh hưởng đồng thời một số yếu tố theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm bậc hai Box-Benken đến quá trình thủy phân giới hạn bã men bia bằng protease nhằm tìm điều kiện tối ưu để thu peptide sinh học
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học
Quy hoạch sử dụng 3 yếu tố cần tối ưu (nồng độ enzym, nồng độ cơ chất, pH) ma trận thực nghiệm được thiết lập gồm 17 thí nghiệm kết hợp các mức (cao, thấp, trung bình) của yếu tố cần khảo sát. Riêng thí nghiệm kết hợp 4 yếu tố ở mức trung bình ( thí nghiệm ở tâm ) được lặp lại 5 lần cố định nhiệt độ 50oC, thời gian thủy phân 16h. Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 3.2
Bảng 3.2. Ma trận thực nghiệm Box-Benken ba yếu tố và hàm lượng peptide thu được trong các điều kiện thủy phân khác nhau
TN Nồng độ Enzyme (%) Nồng độ cơ chất (%) pH Hàm lượng Peptide (mg/ml) Hàm lượng Peptide (mg/g) bã nấm men X1 X2 X3 1 3 15 6.5 25.11 125.55 2 5 15 6.5 25.67 128.35 3 3 25 6.5 40.04 200.2 4 5 25 6.5 44.26 221.3 5 3 20 6.0 33.59 167.95 6 5 20 6.0 36.42 182.1 7 3 20 7.0 33.02 165.1 8 5 20 7.0 34.33 171.65 9 4 15 6.0 24.69 123.45
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học 10 4 25 6.0 40.59 202.95 11 4 15 7.0 22.56 112.8 12 4 25 7.0 41.47 207.35 13 4 20 6.5 38.42 192.1 14 4 20 6.5 37.65 188.25 15 4 20 6.5 36.89 184.45 16 4 20 6.5 37.3 186.5 17 4 20 6.5 38.43 192.15
Kết quả từ bảng 3.2 cho thấy hàm lượng peptide thu được sau khi thủy phân bã nấm men bia bằng chế phẩm protease Neutrase nằm trong khoảng 112,8 đến 221,3 mg/g bã nấm men, tương ứng với các thí nghiệm số 11 và số 4. Ở các mức cực tiểu (thí nghiệm số 1, 2, 9, 11) và cực đại (thí nghiệm số 3, 4, 10, 12) của nồng độ cơ chất hàm lượng peptide thu được chênh nhau rất nhiều cịn ở các mức cực đại và cực tiểu của nồng độ enzyme và pH hàm lượng peptide thu được chênh nhau khơng nhiều nếu xét ở cùng một diều kiện cơ chất. Điều này cho thấy yếu tố nồng độ cơ chất ảnh hưởng rất lớn đến quá trình thủy phân bã men bia. Mặt khác yếu tố pH ảnh hưởng khơng nhiều cĩ thể là do việc chọn các giá trị pH đều nằm trong vùng axit yếu và trung tính bởi bản chất của chế phảm Neutrase là protease trung tính theo khuyến cáo nhà sản xuất.
Bảng 3.3. Kết quả phân tích mơ hình phương sai mơ hình ưu bằng phần mềm DX7.1.5
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học Thơng số SS df MS Chuẩn F Mức cĩ nghĩa p Mơ hình 674.30 9 74.92 221.25 <0.0001 Cĩ ý nghĩa Nồng độ Enzyme (X1) 9.95 1 9.95 29.37 0.0010 Nồng độ cơ chất (X2) 583.62 1 583.62 1723.49 <0.0001 pH (X3) 1.91 1 1.91 5.64 0.0492 X1. X2 3.35 1 3.35 9.89 0.0163 X1. X3 0.58 1 0.58 1.71 0.2328 X2. X3 2.27 1 2.27 6.69 0.0361 X12 4.03 1 4.03 11.89 0.0107 X22 37.65 37.65 111.18 <0.0001 X32 24.66 1 24.66 72.83 <0.0001
Lack of fit 0.51 3 0.17 0.36 0.7840 Khơng cĩ ý nghĩa
* Chú thích: SS: tổng phương sai; df: bậc tự do; MS: trung bình bình phương sai khác; chuẩn F: chuẩn Fisher; Lack of fit: chuẩn đánh giá độ khơng tương thích của mơ hình với thực nghiệm
Luận văn thạc sỹ Cơng nghệ sinh học
Kết quả phân tích phương sai của mơ hình tối ưu bằng phần mềm DX7.1.5 (State- Ease) trình bày trong bảng 3.3 (bảng ANOVA) cho thấy yếu tố nồng độ cơ chất và nồng độ enzyme ảnh hưởng mạnh đến quá trình thủy phân. Chỉ cĩ giá trị pH ảnh hưởng rất ít đến sự thủy phân. Giá trị F của mơ hình là 221,25 với p<0,0001 (p<0,05) cho thấy dạng mơ hình đã được lựa chọn đúng. Giá trị p của “Lack of fit” là 0,7840 (p>0,05) cho thấy mơ hình này tương thích với thực nghiệm
Tuy nhiên, do X1. X3 ( tương tác giữa nồng độ enzyme và pH) cĩ giá trị p>0,05 nên chúng được loại khỏi mơ hình. Phương trình hồi quy biểu hiện hàm lượng peptide mơ tả ảnh hưởng của các yếu tố độc lập và các mối tương tác giữa chúng được biểu