Đối t−ợng vμ ph−ơng pháp nghiên cứu
2.2.1.Tiêu chuẩn chọn đối t−ợng nghiên cứu
• Nhận vào diện nghiên cứu
- Các đối t−ợng đ−ợc chọn là những cặp vợ chồng đã đ−ợc các bác sỹ lâm sàng khám và chẩn đoán là vô sinh.
- Có thời gian kiêng xuất tinh từ 3 - 5 ngày.
- Ng−ời chồng có độ tuổi từ 20 - 49, trong tình trạng khoẻ mạnh. - Xét nghiệm tinh dịch đ−ợc phân loại là thiểu tinh hoặc nh−ợc tinh. Trong tr−ờng hợp bệnh nhân có cả hai đặc điểm trên sẽ đ−ợc lựa chọn vào nhóm thiểu tinh.
• Loại ra ngoài diện đ−ợc xét nghiệm tinh dịch - Những bệnh nhân không đồng ý hợp tác.
- Những ng−ời mắc bệnh tâm thần đang điều trị.
- Những bệnh nhân đang bị nhiễm trùng cấp tính (đang bị sốt).
- Những bệnh nhân đang phải tiến hành các biện pháp điều trị có ảnh h−ởng tới chất l−ợng tinh dịch, tinh trùng (tia xạ, hoá trị liệu, thuốc chống ung th−, thuốc nội tiết).
- Những bệnh nhân không có tinh trùng trong tinh dịch
2.2.2. Ph−ơng pháp nghiên cứu
Sử dụng ph−ơng pháp nghiên cứu dịch tễ học cắt ngang mô tả
2.2.2.1. Lập phiếu xét nghiệm tinh dịch và hormon (có mẫu kèm theo)
- Phần hành chính: những thông tin cá nhân
- Tiền sử: bệnh nhân đ−ợc phỏng vấn trực tiếp và trả lời đầy đủ các câu hỏi trong phần tiền sử, sau đó đ−ợc h−ớng dẫn cẩn thận cách lấy tinh dịch.
2.2.2.2. Kỹ thuật áp dụng
ắ Xét nghiệm tinh dịch đồ
Theo th−ờng qui của Lab bảo quản mô và phôi, Tr−ờng Đại học Y Hà Nội Lấy mẫu
Phòng lấy tinh dịch đ−ợc thiết kế riêng, kín đáo, nằm cạnh phòng xét nghiệm, có nhiệt độ ổn định 20 - 240C.
Bệnh nhân đ−ợc h−ớng dẫn về qui định của phòng xét nghiệm tinh dịch nh− đi tiểu, rửa sạch tay và rửa sạch d−ơng vật tr−ớc khi lấy mẫu, không đ−ợc rửa bằng xà phòng.
Cốc đựng tinh dịch chỉ sử dụng một lần và đ−ợc tiệt trùng.
Thời điểm lấy mẫu xét nghiệm khi bệnh nhân không sốt, không dùng thuốc, không uống r−ợu và đã có thời gian kiêng xuất tinh từ 3 - 5 ngày.
Bệnh nhân dùng tay kích thích d−ơng vật gây phóng tinh, tinh dịch đ−ợc xuất vào một cốc miệng rộng, đã ghi sẵn tên bệnh nhân và ngày giờ lấy mẫu.
Sau khi bệnh nhân lấy đ−ợc mẫu, cốc đựng tinh dịch đ−ợc đ−a ngay vào trong tủ ấm 370C, sau 30 phút lấy ra để lần l−ợt đánh giá các chỉ số.
Khảo sát đại thể
- Màu sắc tinh dịch: quan sát trực tiếp bằng mắt th−ờng. - Thể tích tinh dịch: đo bằng cốc đong có chia vạch.
- Độ quánh tinh dịch: bằng ph−ơng pháp dùng pipette, hút nhẹ tinh dịch vào một pipette pasteur 5 ml, sau đó để cho chảy tự do và ghi nhận độ kéo dài của giọt tinh dịch.
- Độ pH tinh dịch: đo bằng giấy đo pH, loại giấy đo đ−ợc trong khoảng 6,0 - 10,0. Nhỏ 10 μl tinh dịch lên giấy đo pH, sau 30 giây quan sát sự thay đổi màu. So sánh màu sắc trên giấy quì đã đ−ợc nhỏ tinh dịch với bảng màu mẫu để đọc độ pH.
Khảo sát vi thể
Sử dụng kính hiển vi quang học Axiostar plus hãng Calzeiss (Cộng hoà Liên bang Đức) để quan sát và đếm mật độ tinh trùng, đánh giá phân loại đặc điểm di động, tỷ lệ tinh trùng sống, chết và hình thái tinh trùng.
• Đánh giá mật độ và di động tinh trùng bằng buồng đếm chuyên dụng Makler do hãng Sefi - Medical Instruments, Israel sản xuất.
- Mẫu tinh dịch đã ly giải hoàn toàn, không cần pha loãng, phân tích nhanh các giá trị: tỷ lệ % tinh trùng tiến tới nhanh, tiến tới chậm, không tiến tới, không di động; mật độ tinh trùng/ml tinh dịch. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Các b−ớc phân tích mẫu tinh dịch
+ Nhỏ 20 μl nguyên mẫu tinh dịch vào giữa mặt trên tấm kính. Đặt tấm kính phủ lên 4 trụ thạch anh.
+ Đặt nhẹ nhàng buồng đếm lên mâm kính hiển vi với vật kính x 20, thị kính x15 dùng riêng cho buồng đếm Makler. Nhận xét sơ bộ phân bố tinh trùng xem có đều và có cùng trên mặt phẳng tiêu cự.
+ Đánh giá độ di động của tinh trùng dựa trên sự phân chia mức độ di động của tinh trùng (trong 5 phút đầu) ở 4 mức:
a: di động tiến tới, nhanh b: di động tiến tới, chậm c: di động tại chỗ
d: không di động.
Đếm 200 tinh trùng trên nhiều vi tr−ờng, sau đó tính tỷ lệ phần trăm mỗi loại, sử dụng máy đếm bạch cầu. Trên mỗi vi tr−ờng, đếm theo trình tự những tinh trùng loại a đếm tr−ớc rồi đến loại b, loại c và loại d.
+ Xác định mật độ tinh trùng: lấy vài giọt nguyên mẫu tinh dịch cho vào ống nghiệm loại 2 ml. Nhúng vào cốc n−ớc ấm 600C trong 5 phút. Đếm trên buồng đếm.
Nếu số l−ợng tinh trùng phong phú: đếm số tinh trùng trong 10 ô vuông (nh− đếm huyết cầu), đ−ợc số A, mật độ tinh trùng là: A x 106 tinh trùng/ml, lặp lại các thao tác ở 10 ô khác, lấy trung bình cộng.
Nếu số l−ợng tinh trùng ít: đếm toàn bộ tinh trùng trong buồng đếm (100 ô vuông) đ−ợc tổng số tinh trùng A. Mật độ tinh trùng sẽ là A x 105 tinh trùng/ml.
• Đánh giá tỷ lệ tinh trùng sống, chết: bằng ph−ơng pháp nhuộm Eosin - Nguyên lý xét nghiệm: những tinh trùng chết, màng bào t−ơng vỡ hoặc có thể bị tổn th−ơng nên các thuốc nhuộm có thể ngấm qua màng bào t−ơng vào trong. Những tinh trùng chết bắt màu hồng của thuốc nhuộm. Những tinh trùng sống không bắt màu thuốc nhuộm và có hình ảnh sáng trắng.
- Đếm tổng cộng 200 tinh trùng trên nhiều vi tr−ờng, sử dụng máy đếm bạch cầu, tính tỷ lệ phần trăm.
• Đánh giá hình thái tinh trùng
- Kỹ thuật nhuộm phiến đồ: dùng ph−ơng pháp nhuộm HE (Hematoxylin - Eosin), theo qui trình th−ờng qui, gồm các b−ớc sau:
+ Làm sạch lame bằng cồn 70o để khô.
+ Nếu mật độ tinh trùng > 20 x106/ml, nhỏ 10 - 20 μl tinh dịch lên lame để khô tự nhiên.
+ Nếu tinh dịch có độ nhớt cao: ly tâm lấy cặn, pha loãng với n−ớc muối sinh lý sao cho mật độ < 80 x 106/ml. Nhỏ 5 μl lên lam kính, dàn đều tinh dịch lên lame, để khô tự nhiên, cố định bằng carnoy rồi tiến hành nhuộm màu theo ph−ơng pháp nhuộm nối tiếp. Nhuộm màu trong dung dịch Hemalum de Mayer → rửa bằng n−ớc th−ờng → nhuộm trong dung dịch eosin → lên kính.
+ Sau đó tiến hành phân loại hình thái tinh trùng: đếm 200 tinh trùng d−ới vật kính dầu 100x và thị kính 10 (độ phóng đại 1000 lần), không đếm
những tinh trùng nằm chồng lên nhau hoặc quấn vào nhau. Đếm bằng máy bách phân bạch cầu.
Các dạng hình thái tinh trùng bất th−ờng trong mẫu tinh dịch ng−ời đ−ợc phân loại chi tiết và tính tỷ lệ phần trăm mỗi loại nh− sau.
• Bất th−ờng đầu tinh trùng
Bất th−ờng túi cực đầu, túi cực đầu nhỏ (< 40% diện tích vùng đầu) hoặc to (> 70% diện tích vùng đầu)
Đầu dạng bất định, hình dáng không bình th−ờng. Có không bào (> 20% diện tích vùng đầu)
Đầu hình nến Đầu hình quả lê Đầu tròn
Đầu có bào t−ơng bất th−ờng Không đầu
Nhiều đầu
Bất th−ờng nhân và màng nhân • Bất th−ờng cổ
Cổ gãy, cổ cong: cổ không thẳng trục với đầu hoặc gập góc > 900 Cổ dày có bào t−ơng bất th−ờng
Cổ không đều và mảnh • Bất th−ờng đuôi Đuôi cuộn Đuôi ngắn Không đuôi Đuôi gập Nhiều đuôi
Đuôi có bào t−ơng bất th−ờng: chiều rộng đuôi không đều (coi là bất th−ờng khi chiều rộng đuôi > 1/3 diện tích vùng đầu). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
• Bất th−ờng phối hợp
Khi có sự phối hợp từ 2 dạng bất th−ờng trên trở lên, bao gồm: Bất th−ờng đầu và cổ
Bất th−ờng đuôi và cổ Bất th−ờng đầu và đuôi Bất th−ờng đầu, cổ, đuôi
ắ Chụp ảnh tất cả các dạng hình thái tinh trùng ở các tiêu bản đã đ−ợc nhuộm màu trên kính hiển vi hãng Nikon của Nhật Bản, với độ phóng đại 1000 lần. Sử dụng một loại Film Kodak 200 ASA.
Các cuộn film chụp tinh trùng đ−ợc rửa ở chế độ nền sáng bởi một kỹ thuật viên chuyên nghiệp của một cơ sở ảnh màu.
ắ Đo kích th−ớc tinh trùng
Thu ảnh từ tiêu bản bằng camera gắn vào kính hiển vi tr−ờng sáng và ghi vào bộ nhớ của máy tính. Sau đó dùng phần mềm định l−ợng Anxiovision LE trên máy vi tính tiến hành đo trên ảnh (độ phóng đại của ảnh đã đ−ợc ch−ơng trình phần mềm tính toán và qui đổi ra μm), đo chiều dài toàn bộ tinh trùng; chiều dài, chiều rộng đầu; chiều dài cổ; chiều dài đuôi, tỷ lệ diện tích túi cực đầu/diện tích đầu.Chỉ đo các tinh trùng có hình thái vi thể bình th−ờng.
+ Đo chiều dài đầu: với mốc xác định từ cực tr−ớc của đầu tới ranh giới giữa đầu và cổ tinh trùng.
+ Đo chiều rộng đầu: đo ở khoảng cách có chiều rộng lớn nhất + Đo diện tích túi cực đầu
+ Đo diện tích đầu
+ Đo chiều dài cổ: với mốc xác định từ ranh giới giữa đầu và cổ tinh trùng cho tới ranh giới giữa cổ và đoạn trung gian.
+ Đo chiều dài đuôi: từ ranh giới giữa đoạn cổ và đoạn trung gian đến hết. + Tính tỷ lệ diện tích túi cực đầu/diện tích đầu
ắ Kỹ thuật làm tiêu bản siêu cấu trúc của tinh trùng quan sát d−ới kính hiển điện tử quét Jcol JCM - 5410LV.
- Ly tâm tinh dịch để lấy cặn
- Tiền cố định bằng glutaraldehyt 2,5%. - Hậu cố định bằng acid osmic 1%. - Làm lạnh ở - 1960C, bẻ gẫy mẫu. - Phủ mẫu bằng clorua vàng
- Soi bằng kính hiển vi điện tử quét Jcol JCM - 5410LV với độ phóng đại: 2.000, 7.500, 15.000 lần.
- Chụp ảnh các hình ảnh siêu vi thể tinh trùng
ắ Kỹ thuật làm tiêu bản siêu cấu trúc của tinh trùng quan sát d−ới kính hiển điện tử truyền qua JEM 1010 của hóng JEOL ở các độ phóng đại: 5.000, 8.000, 10.000, 15.000, 20.000, 25.000 lần.
- Ly tâm tinh dịch trong tuýp đáy nhọn 14 ml, tốc độ 1400 vòng/10 phút. Hút bỏ dịch nổi để lại cặn.
- Vùi agar: nhỏ 0,3 ml dung dịch agar 2 - 4 % vào cặn của tinh dịch và khuấy đều bằng que tre.
- Tiền cố định bằng glutaraldehyt 2,5% trong đệm phosphat pH = 7,2 trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng.
- Rửa bằng đệm phosphat pH = 7,2 pha với sacarose 8%: 15 phút x 3 lần. - Hậu cố định bằng acid osmic 1% pha trong đệm phosphat pH = 7,2 trong 2 - 4 giờ ở nhiệt độ phòng.
- Rửa bằng đệm phosphat - sacarose 8%: 15 phút x 3 lần.
- Hút n−ớc bằng cồn etylic: 30%, 50%, 70%, 85%, 95%, 100%, 100%, 100%. Mỗi lọ để trong thời gian 10 - 15 phút ở nhiệt độ phòng.
- Ngấm epoxy: Propylene oxyde: 10 phút x 3 lần. Sau đó lần l−ợt trong propylene oxyde/epoxy với tỷ lệ: 2/1, 1/1, 1/2, mỗi loại trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Cuối cùng ngấm epoxy qua đêm ở nhiệt độ phòng
- Đúc bằng vỏ gelatin
- Trùng hợp ở nhiệt độ 600C trong 48 giờ. - Gọt block
- Cắt siêu mỏng
- Nhuộm bằng uranyl acetate 1% và citrate chì - Soi và chụp ảnh.
ắ Xét nghiệm định l−ợng nồng độ FSH, LH, testosteron huyết thanh Đối t−ợng đ−ợc lựa chọn lấy máu làm xét nghiệm định l−ợng nồng độ hormon là tất cả những ng−ời chồng có tinh dịch đồ bất th−ờng thuộc 2 nhóm thiểu tinh và nh−ợc tinh. Bệnh nhân đ−ợc h−ớng dẫn, giải thích chu đáo và phát phiếu hẹn xét nghiệm, đ−ợc thông báo ngày hôm sau nhịn ăn sáng đến làm xét nghiệm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tổ chức lấy máu xét nghiệm vào đầu giờ sáng, khi bệnh nhân ch−a ăn. Mỗi mẫu máu đ−ợc ghi rõ họ tên, tuổi, mã số của bệnh nhân, ngày lấy máu. Mã số trùng với mã số khi phỏng vấn và xét nghiệm tinh dịch. Mỗi bệnh nhân lấy 3 ml máu tĩnh mạch bằng bơm tiêm dùng một lần. Khi lấy máu xong, bỏ kim tiêm, bơm nhẹ nhàng máu vào ống nghiệm, sử dụng ống không có chất chống đông. Các ống chứa máu đ−ợc đặt trong các giá để ống nghiệm ở nhiệt độ phòng. Sau 1 - 2 giờ để lắng, các ống nghiệm đựng mẫu máu đ−ợc ly tâm trong thời gian 15 phút, với tốc độ 1500 vòng/phút bằng máy ly tâm Centrifuge model 80 - 2 để tách huyết thanh. Sau khi ly tâm dùng ống nhỏ giọt vô trùng hút huyết thanh chuyển sang ống nghiệm trữ lạnh chuyên dụng của hãng Eppendorf bằng nhựa đáy nhọn, có nắp, cỡ 1,8 ml, vô trùng. Các ống huyết thanh đ−ợc xếp vào giá đỡ, bảo quản trong tủ lạnh sâu - 850C. Sau mỗi khoảng thời gian 2 tuần/lần, các mẫu đ−ợc chuyển về Tr−ờng Đại học Y Thái Bình để phân tích. Trong quá trình vận chuyển, mẫu huyết thanh liên tục đ−ợc bảo quản trong bình bảo ôn, có các túi đá gel xếp xung quanh và đậy lên trên giá đỡ bằng xốp đựng các ống huyết thanh. Sau 2 giờ, mẫu đ−ợc chuyển đến labo trung tâm Tr−ờng Đại học Y Thái Bình và tiến hành ngay xét nghiệm.
Định l−ợng nồng độ FSH, LH, testosteron huyết thanh bằng hệ thống hoá phát quang miễn dịch tự động ACS 180 của hãng Bayer, Cộng hoà liên bang Đức. Sử dụng bộ kít đồng bộ của hãng Bayer. Xét nghiệm dựa trên nguyên tắc dùng hai kháng thể đơn dòng, đặc hiệu “kẹp” vào hai đầu của chất thử (hormon), áp dụng công nghệ hoá phát quang trực tiếp.
Giá trị bình th−ờng của FSH, LH, testosteron huyết thanh theo h−ớng dẫn của hãng bằng ph−ơng pháp định l−ợng trên hệ thống hoá phát quang miễn dịch tự động ACS 180: FSH: 5 - 10 mIU/ml; LH: 5 - 10 mIU/ml; Testosteron: 10 - 35 nmol/l.
2.2.2.3. Xử lý số liệu
Các số liệu đ−ợc xử lý theo ch−ơng trình Epi-Info Version 6.0, ch−ơng trình SPSS 13.0 trên máy vi tính.
Thống kê mô tả sử dụng các test t - student, test F.
Các thuật toán phân tích t−ơng quan hồi quy tuyến tính cho 2 biến liên tục (liner regresion), t−ơng quan bội r(x,y,z) cho nhiều biến đ−ợc sử dụng để tìm mối t−ơng quan giữa hình thái tinh trùng với các thông số khác.
Tỉ suất chênh OR và khoảng tin cậy (95% CI) đã đ−ợc tính toán cho sự liên quan giữa các yếu tố.
Các số liệu đ−ợc trình bày d−ới dạng tỷ lệ % và các bảng, biểu, đồ thị, hình ảnh.