3. Nội dung nghiên cứu
1.6. Một số sản phẩm probiotic dùng trong chăn nuôi thủy sản trên thị trƣờng
trƣờng hiện nay
Hiện nay trên thị trƣờng có bán rất nhiều chế phẩm sinh học dƣới nhiều dạng khác nhau. Những chế phẩm này đƣợc dùng trong chăn nuôi và thủy sản nhƣ:
Enzymbiosub của công ty Vaccin và Sinh Phẩm Số 2. Công thức bào gồm: β- Glucanase, Bacillus subtillis, Protease, Amylase. Công dụng Cải tạo nền đáy: Giúp tăng lƣợng vi sinh vật có lợi và men hữu ích giúp phân hủy các chất dơ bẩn nhƣ cặn bã hữu cơ và thức ăn thừa trong ao nuôi;Cải thiện môi trƣờng: Tạo màu nƣớc xanh, làm giàu dinh dƣỡng tự nhiên;Cung cấp enzym tiêu hóa và vi khuẩn có lợi cho đƣờng ruột, giúp tiêu hóa thức ăn, tăng hiệu quả hấp thụ thức ăn, tăng tỷ lệ sống, tăng sức đề kháng cho thủy sản.Phòng bệnh đƣờng ruột, phân trắng, phân đứt khúc.
Chế phẩm men vi sinh EBS của công ty Vaccin và Sinh Phẩm Số 2 đƣợc dùng kích thích tôm, cá sử dụng triệt để nguồn thức ăn, giúp tôm, cá tiêu hóa tốt thức ăn và tăng trọng nhanh. Cải thiện môi trƣờng nƣớc, kích thích tảo có lợi, phiêu sinh vật phù du có trong ao nuôi, tạo nguồn thức ăn tự nhiên dồi dào cho tôm, cá. Ổn định hệ vi sinh vật có lợi trong đƣờng ruột, lấn át, tiêu diệt các vi khuẩn có hại. Phòng và điều trị có hiệu quả các bệnh đƣờng tiêu hóa, bệnh phân trắng, bệnh nhiễm trùng đƣờng ruột cho tôm, cá…
Baciflora For Shrimp của công ty liên doanh Bio – Pharmachemie. Thành phần gồm: B.lichenifomic, B.megaterium, B.mencentericus, Nitrosomonas Nitrosobacter có tác dụng phân hủy xác tảo, thức ăn thừa, chất hữu cơ lơ lửng trong ao nuôi, ức chế sự phát triển của các vi khuẩn có hại; Ổn định sự phát triển của các sinh vật phù du trong ao, tránh đƣợc hiện tƣợng nở hoa do phì nhƣỡng; Ổn định màu nƣớc, pH nƣớc ao trong khoảng thích hợp, giảm hàm lƣợng khí độc NH3, H2S trong ao.
Ngoài các chế phẩm trong nƣớc còn có rất nhiều loại chế phẩm của nƣớc ngoài đƣợc dùng trong chăn nuôi và thủy sản nhƣ: Protexin, Unleash, hay Florazyme efa ….
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu và lý do chọn đối tƣợng nghiên cứu
Với mục đích tạo ra sản phẩm sử dụng có hiệu quả để xử lý môi trƣờng nuôi trồng thủy sản và phòng ngừa bệnh cho đối tƣợng nuôi thủy sản, chúng tôi đã chọn ra 5 chủng vi sinh vật thuộc tập đoàn giống do công ty cổ phần thuốc thú y Đức Hạnh Marphavet và viện Thú y phân lập và sƣu tầm để nghiên cứu. Đó là những chủng vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Bacillus, Lactobacillus và
Rhodospirillacease.
Các chủng Bacillus đƣợc chọn: B.licheniformis G1, B.subtilis DA và B.megaterium PA. Các chủng đều mang những đặc điểm cơ bản, cần thiết cho việc sử dụng để sản xuất chế phẩm xử lý môi trƣờng nuôi trồng thủy sản: sinh enzym phân hủy hữu cơ, chịu mặn và đặc biệt đảm bảo an toàn cho ngƣời và vật nuôi [11,12].
Vi khuẩn Lactobacillus đƣợc chọn để kiểm soát vi sinh vật trong môi trƣờng là L.acidophilus TN đây là trực khuẩn kỵ khí tùy tiện có khả năng lên men lactic điển hình, có khả năng lên men sữa sinh ra axit lactic. Đáng chú ý là loại vi khuẩn này ức chế mạnh sự phát triển của loài Vibrio gây bệnh tôm (V.parahaemolyticus, V.fuonisi). L.acidophilus TN cũng có khả năng chịu mặn nên có thể tồn tại trong môi trƣờng nƣớc nuôi. Việc ứng dụng L.acidophilus TN
trong nuôi trồng thủy sản ngoài tác dụng kiểm soát vi sinh vật gây bệnh, ổn định môi trƣờng nƣớc nuôi, chúng còn đƣợc sử dụng để sản xuất chế phẩm phòng trị bệnh đƣờng ruột tạo ra những thay đổi về khu hệ vi sinh vật đƣờng ruột theo hƣớng cân bằng có lợi, trong đó các vi sinh vật tăng lên đáng kể, các vi sinh vật có khả năng gây bệnh (E.coli, Aeromonsa, Salmonella) giảm đáng kể [20].
Đối tƣợng khác đƣợc chọn trong nghiên cứu là vi khuẩn tía khử H2S
Rhodopseudomonas palustris RD thuộc nhóm vi khuẩn tía không lƣu huỳnh, có khả năng khử H2S và đƣợc gọi là vi khuẩn quang dƣỡng, sống kị khí hoặc kị khí tùy tiện trong môi trƣờng có ánh sáng chiếu rọi. Chúng là các vi sinh vật điển hình, rất phổ biến ở nƣớc ngọt cũng nhƣ nƣớc mặn, thƣờng cƣ trú khá nhiều trên
bề mặt bùn các ao đầm tù hãm có nhiều bùn cặn xác động thực vật. Chúng có khả năng sử dụng H2S thay H2O trong qua trình quang hợp làm giảm độ ô nhiễm, mùi hôi thối và làm trong màu nƣớc ao, hồ.
2.2. Hóa chất và thiết bị sử dụng 2.2.1. Hóa chất 2.2.1. Hóa chất
Glucoza, MgSO4.7H2O; NaCl; K2HPO4; CaCO3; FeCl3.6H2O; Pepton; Cao nấm men; cao malt; Tween 80; Cao thịt; KI, I2 các hóa chất khác của hãng Merck, Sigma,... do công ty cổ phần hóa chất Á Châu ( Tên viết tắt là ACC), địa chỉ 364 Cộng Hòa – 13 Tân Bình – Hồ Chí Minh cung cấp.
2.2.2. Thiết bị
Các máy móc, dụng cụ đƣợc sử dụng có tại phòng thí nghiệm công ty thuốc thú y Marphavet. Địa chỉ tại Thanh Tân – Trung Thành – Phổ Yên – Thái Nguyên. Đây là công ty sản xuất thuốc thú y có phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn của tổ chức y tế thế giới WHO – GLP ( Good laboratory practice) cấp năm 2011. Bao gồm:
TT Tên thiết bị model Nhà sản xuất
1 Hệ thống lên men sục khí D21000854 Sartorius – Đức 2 Cân phân tích điện tử 10-4
g (220g) XB 220A Precisa - Thụy Sỹ 3 Cân kỹ thuật điện tử (620mg) BL 620S Shimadzu - Nhật Bản 4 Máy đo pH HM - 25R Toa DKK - Nhật Bản 5 Máy phân tích độ ẩm XM 60 Precisa - Thụy Sỹ 6 Tủ cấy vi sinh ACB-4A1 Sesco/Singapore 7 Tủ sấy DX-402 Yamato - Nhật Bản 8 Tủ ấm IC 402 Yamato - Nhật Bản 9 Nồi hấp tiệt trùng SQ-510 Yamato - Nhật Bản 10 Máy khuấy từ gia nhiệt MST- digital IAK - Đức
2.3. Môi trƣờng nghiên cứu 2.3.1. Môi trƣờng MRS (g/l) 2.3.1. Môi trƣờng MRS (g/l)
Đƣờng Glucose 20,0 K2HPO4 2,0
CaCO3 5,0 CH3COONa 5,0
Cao thịt 10,0 Triamoni xitrat 2,0 Pepton 10,0 MgSO4.7H2O 0,58 Cao nấm men 5,0 MnSO4.4H2O 0,28 Tween 80 1 ml Nƣớc cất vừa đủ 1000 ml pH = 7,0; khử trùng 1210
C/15 phút Agar 15,0 Môi trƣờng dịch thể bỏ agar và CaCO3
2.3.2. Môi trƣờng SA (g/l)
Sodium acetate 1 NaCl 0,2 Sodium succinate 1 CaCl2.2H2O 0,05 KH2PO4 0,5 Na2S2O3.5H2O 0,1 K2HPO4 0,6 Cao nấm men 0,1 (NH4)2SO4 1 Hỗn hợp vitamin 1 ml MgSO4.7H2O 0,2 Dung dịch vi lƣợng 1 ml Nƣớc cất vừa đủ 1000 ml Agar 15 pH = 6,,8-7,0.Tiệt trùng 1210C/15 phút Môi trƣờng dịch thể bỏ agar
2.3.3. Môi trƣờng MPA (g/l) Cao thịt 5 NaCl 5 Cao thịt 5 NaCl 5 Pepton 10 Agar 15 pH = 6,8 – 7,0 Nƣớc cất vừa đủ 1000 ml Tiệt trùng 1210 C/15 phút Môi trƣờng dịch thể bỏ agar
2.3.4. Dung dịch vi lƣợng (g/l) EDTA-2Na 1 CoCl2.6H2O 20 mg EDTA-2Na 1 CoCl2.6H2O 20 mg FeCl3 2 Na2MO4.2H2O 10 mg ZnCl2 0,1 CuCl2.2H2O 10 mg MnCl2 0,1 Na2SeO3 5 mg H3BO3 0,1 Nƣớc cất 1000 ml 2.3.5. Hỗn hợp vitamin (mg/ml) Thiamin – HCl 50 Biotin 5,0 Niacin 50 Vitamin B12 5,0 p-aminobenzoic acid 30 Nƣớc cất vừa đủ 100 ml Pyridoxal- HCl 10 2.3.5. Môi trƣờng CMC (g/l) (NH4)2SO4 1 CMC 10 K2HPO4 1 agar 20 MgSO4.7H2O 0.5 Nƣớc cất vừa đủ 1000 ml NaCl 0.001 pH 7
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu và xác định các chỉ tiêu nghiên cứu
2.4.1. Phƣơng pháp lựa chọn chủng vi khuẩn sử dụng để sản xuất chế phẩm sinh học - Khả năng chịu mặn: Môi trƣờng sử dụng để kiểm tra khả năng chịu mặn - Khả năng chịu mặn: Môi trƣờng sử dụng để kiểm tra khả năng chịu mặn là môi trƣờng MPA đối với Bacillus; MRS đối với L.acidophillus TN và SA đối với R.palustris RD, có bổ sung NaCl với nồng độ 1%, 3%, 5%, 7%, 10%. Đánh giá sự phát triển của vi khuẩn sau 48 giờ nuôi cấy. Các mẫu thí nghiệm đều phân tích so với đối chứng có nồng độ muối tƣơng ứng. Phân tích mật độ vi khuẩn trong dịch nuôi bằng cách đếm trên đĩa thạch theo phƣơng pháp của Koch và thông qua chỉ số mật độ quang (OD660).
- Khả năng đối kháng: Kiểm tra với Vibrio parahaemolticus (Vp), Vibrio fuonisi (Vf) trên đĩa môi trƣờng thạch đĩa MPA (Bacillus); MRS (L.acidophillus
TN). Các chủng cần kiểm tra cấy chấm điểm vào đĩa thạch đã bổ sung Vp, Vf. Quan sát vòng kháng khuẩn sau 24 – 48 giờ.
- Khả năng sinh protease [4]: Kiểm tra trên môi trƣờng MPA (Bacillus); MRS (L.acidophillus TN) có bổ sung 10% sữa đã đƣợc tách béo và thanh trùng. Cấy chủng và quan sát vòng thủy phân xung quanh khuẩn lạc.
- Khả năng sinh amylase [4]: cấy chủng Bacillus và L.acidophillus TN
trên môi trƣờng có bổ xung tinh bột. Sau khi vi khuẩn phát triển, nhỏ dung dịch Lugol, quan sát vòng thủy phân tinh bột xung quanh khuẩn lạc.
- Khả năng sinh cellulase [4]: Trên môi trƣờng chứa CMC, vi khuẩn sẽ tiết ra cellulase ngoại bào phân hủy cơ chất để sinh trƣởng và làm cho môi trƣờng trong hơn khi nhuộm bằng thuốc thử Lugol. Độ lớn của khoảng môi trƣờng trong suốt và vệt cấy phản ánh khả năng sinh trƣờng phát triển và phân giải CMC của vi khuẩn.
- Khả năng sinh trƣởng trong các nguồn nƣớc thải: Sử dụng nƣớc thải ở một số vùng có hàm lƣợng chất hữu cơ cao: nƣớc thải chăn nuôi, nƣớc thải kênh ô nhiễm, nƣớc thải làng nghề sản xuất bún. Các nguồn nƣớc thải sau khi đƣợc khử trùng đƣợc sử dụng làm môi trƣờng để nuôi cấy chủng R.palustris RD. Thí nghiệm đƣợc tiến hành trong điều kiện kị khí và chiếu sáng. Theo dõi mức độ tích lũy sinh khối của chủng nuôi cấy sau một tuần thông qua chỉ số mật độ quang (OD660).
- Kiểm tra độ an toàn của các chủng nghiên cứu: Thử độc tính cấp trên chuột nhắt trắng đƣợc tiến hành trên 50 con chia làm 5 nhóm, nhóm đối chứng dùng nƣớc cất và 4 nhóm thử mẫu với liều khác nhau. Các mức liều cao uống 2- 3 lần/ ngày, cách nhau 3 giờ. Theo dõi chuột 5 ngày sau khi cho uống.
2.4.2. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nhân giống
- Ảnh hƣởng của tỷ lệ giống: Bổ sung giống với tỷ lệ 5%, 7,5%, 10%, theo dõi sự sinh trƣởng và phát triển qua xác định OD660nm, CFU/ml
- Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng: Điều chỉnh pH môi trƣờng đạt 5,5; 6; 6,5 đối với vi khuẩn L.acidophillus TN. Xác định pH môi trƣờng sau khi nuôi cấy, OD620nm, CFU/ml.
- Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến tích lũy sinh khối: Khảo sát khả năng sinh trƣởng và phát triển của R.palustris RD trên môi trƣờng SA lỏng, điều kiện kị khí, chiếu sáng, ủ ở các khoảng nhiệt độ: 20, 25, 30, 35, 40, 45 và 500
C.
- Ảnh hƣởng của thời gian nhân giống: Khả năng sinh trƣởng và phát triển của Bacillus, L.acidophillus TN, R.palustris RD sau 16, 20, 24, 36, 48 giờ đƣợc theo dõi qua xác định pH, OD660nm, CFU/ml
2.4.3. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men
- Thành phần lên men chìm Bacillus, L.acidophillus TN, R.palustris RD
thích hợp đƣợc lựa chọn trên cơ sở môi trƣờng nhân giống Bacillus, có thay đổi một số thành phần phù hợp, dễ kiếm, rẻ tiền. Xác định CFU/ml dịch lên men bằng cách phân tích mật độ vi khuẩn trong dịch nuôi bằng cách đếm trên đĩa thạch theo phƣơng pháp của Koch.
- Thời gian lên men Bacillus, L.acidophillus TN, R.palustris RD thích hợp đƣợc nghiên cứu qua theo dõi xác định OD660nm, CFU/ml dịch lên men
- Xác định thành phần lên men L.acidophillus TN trên môi trƣờng xốp thích hợp bằng cách lên men trên cơ chất là nguồn cacbon ( đƣờng sucrose, lactose, glucose, maltose, mannitol); chất mang; bột đậu tƣơng, bột gạo, bột sắn, bột cám với tỷ lệ khác nhau. Xác định CFU/gam chế phẩm lên men.
- Xác định thành phần lên men Bacillus trên môi trƣờng xốp trên nguồn cơ chất bao gồm: đậu tƣơng, bột gạo, bột cám. Xác định CFU/gam chế phẩm lên men.
- Tỷ lệ giống thích hợp để lên men Bacillus trên môi trƣờng xốp đƣợc nghiên cứu: 20%, 25%, 30%, 35%. Xác định CFU/ gam chế phẩm lên men.
- Nhiệt độ lên men Bacillus, L.acidophillus TN trên môi trƣờng xốp thích hợp đƣợc nghiên cứu: 280
C, 300C, 340C, 370C. Xác định CFU/ gam chế phẩm lên men.
- Xác định thời gian lên men Bacillus, L.acidophillus TN trên môi trƣờng xốp thích hợp bằng cách lên men 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8 ngày, xác định CFU/ gam chế phẩm lên men
Thu hồi sinh khối tạo chế phẩm và bảo quản chế phẩm
- Tạo chế phẩm dạng lỏng: Dịch lên men Bacillus đã đƣợc thu hồi, bổ sung L.acidophillus TN và R.palustris RD cũng đƣợc thu hồi và cho thêm chất bảo quản. Kiểm tra độ tinh khiết, chất lƣợng ( CFU/ml chế phẩm: 108
).
- Tạo chế phẩm dạng bột: Chế phẩm lên men Bacillus đã đƣợc sấy khô với nhiệt độ 50, 60, 65, 700C, nghiền, bổ sung chế phẩm lên men L.acidophillus TN cũng đƣợc sấy khô, nghiền nhỏ. Kiểm tra độ tinh khiết, chất lƣợng (CFU/gam chế phẩm: 108
)
- Thành lập công thức bảo quản chế phẩm dạng bột gồm: Bacillus, L.acidophillus TN thêm một số thành phần sau: bột, sucrose, lactose, Na2CO3. Theo dõi độ ổn định 3, 6, 12 tháng.
- Thành lập công thức bảo quản chế phẩm dạng lỏng với các thành phần bảo quản: sucrose; Lactose, Na2S2O3 + Lactose. Theo dõi độ ổn định 3, 6, 12 tháng.
2.4.4. Phƣơng pháp định tính vi khuẩn nghiên cứu
Định tính vi khuẩn Bacillus, L.acidophillus TN, R.palustris RD dựa trên nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, bào tử, đặc điểm sinh hóa [12, 18, 19, 21].
- Xác định đặc điểm khuẩn lạc: Quan sát đặc điểm khuẩn lạc của Bacillus
trên môi trƣờng MPA; L.acidophillus TN trên môi trƣờng MRS và của
R.palustris RD trên môi trƣờng SA bổ sung agar. Cấy các vi khuẩn trên môi trƣờng thích hợp, nuôi 24-48h. Chọn những đĩa thạch có khuẩn mọc riêng rẽ để quan sát.
- Xác định hình thái tế bào, bào tử: Có thể sử dụng môi trƣờng lỏng hay môi trƣởng thạch để quan sát đặc điểm hình thái tế bào, bào tử. Vi khuẩn sau khi đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng thích hợp, làm tiêu bản, nhuộm Gram. Quan sát
hình dạng tế bào, cách sắp xếp, bào tử trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần.
- Khả năng sinh enzyme catalase: Sử dụng môi trƣờng MRS đối với
L.acidophillus TN và môi trƣờng MPA với Bacillus. Vi khuẩn sau khi nuôi cấy, hòa thành hỗn dịch với 1 giọt nƣớc oxy già (3-5% H2O2). Vi khuẩn sinh catalase tạo thành bọt khí.
- Khả năng lên men đƣờng sinh axit: sử dụng môi trƣờng thạch bán lỏng MRS đối với L.acidophillus TN và môi trƣờng MPA với Bacillus, bổ sung đƣờng sucrose, mannose, bổ sung chất chỉ thị màu ( xanh metylen), cho vào ống nghiệm, khử trùng. Cấy vi khuẩn cần xác định lên môi trƣờng, nuôi 5 ngày. Quan sát sự phát triển và sự chuyển màu của môi trƣờng.
- Lên men làm đông sữa, sinh axit: Môi trƣờng để xác định gồm sữa ông thọ 30%. Sữa đƣợc thanh trùng, để nguội. Cấy vi khuẩn cần xác định. Nuôi 24- 48h. Quan sát mức độ đông, mùi, vị sữa lên men.
- Khả năng sử dụng sulfua của chủng R.palustris RD: nuôi cấy chủng trong môi trƣờng có chứa Na2S với hàm lƣợng 2mM ( tƣơng đƣơng 64mgD/L). Thí nghiệm tiến hành trong điều kiện kị khí, chiếu sáng. Xác định hàm lƣợng sulfua còn lại trong môi trƣờng sau 5 ngày nuôi cấy.
Phương pháp xác định độ tinh khiết của chế phẩm:
- Độ tinh khiết của chế phẩm đƣợc xác định trên môi trƣờng MRS đối với
L.acidophillus TN; môi trƣờng MPA với Bacillus và môi trƣờng SA với
R.palustris RD. Chế phẩm chỉ bao gồm những vi khuẩn nghiên cứu.
Phương pháp định lượng
- Xác định số lƣợng tế bào vi khuẩn trong 1g ( 1ml) chế phẩm trên môi trƣờng MRS đối với L.acidophillus TN; MPA với Bacillus và T với R.palustris RD. Cân 1g hoặc hút 1ml chế phẩm vào bình nón chứa NaCl 0,9%. Hòa loãng chế phẩm để đạt đƣợc những nồng độ pha loãng 10-4
, 10-5. Nuôi và đếm số khuẩn lạc ở các