3. Nội dung nghiên cứu
3.2.2.Kết quả nghiên men Bacillus, Lactobacillus trên môi trƣờng xốp
Lên men Lactobacillus trên môi trường xốp
Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men trên môi trƣờng xốp nhƣ: thành phần môi trƣờng, nhiệt độ, tỷ lệ giống, thời gian.
Tỷ lệ giống Lactobacillus thích hợp đƣợc khảo sát nhằm tối ƣu quá trình lên men trên môi trƣờng xốp. Trong quá trình lên men trên môi trƣờng xốp, tỷ lệ
giống thích hợp còn có tác dụng đảm bảo độ ẩm môi trƣờng lên men, giảm pH trong môi trƣờng và giảm sự lây nhiễm trong quá trình lên men. Tỷ lệ giống đƣợc khảo sát: 20, 30, 50, 65%. Kết quả cho thấy tỷ lệ giống 30% là thích hợp nhất (Bảng 3.17).
Bảng 3.17: Tỷ lệ giống thích hợp
Tỷ lệ giống (%) CFU/g chế phẩm lên men
20 6,8.108
30 9,7.108
50 3,1.108
65 8,5.107
Đối với vi khuẩn L.acidophillus, nguồn bột có tác dụng nhƣ chất phụ gia, chất mang và chất bảo quản vi khuẩn. Cơ chất không thể thiếu trong quá trình lên men L.acidophillus là nguồn cacbon, 5 loại đƣờng thƣờng đƣợc sử dụng để len men Lacto trên môi trƣờng xốp: sucrose, glucose, lactose, maltose, mannitol. Kết quả cho thấy L.acidophillus TN sử dụng tốt đƣờng sucrose, glucose, sử dụng maltose hiệu quả kém và hầu nhƣ không sử dụng đƣờng lactose và mannitol. Nhƣ vậy, glucose, sucrose là nguồn cacbon thích hợp để lên men Lactobacillus
trên môi trƣờng xốp với mật độ tế bào đạt đƣơc 109
CFU/g chế phẩm lên men (bảng 3.18).
Bảng 3.18: Nguồn cacbon thích hợp đối với lên men Lactobacillus trên môi trƣờng xốp
Nguồn cacbon CFU/g chế phẩm lên men
Sucrose 9,1.109
Glucose 4,2.109
Lactose 9,5.108
Maltose 1,3.108
Thời gian lên men đƣợc theo dõi sau 1, 2, 4, 6 và 8 ngày thấy rằng: sau 2 ngày lên men, số lƣợng tế bào đạt đƣợc: 5,8.109
CFU/g và ổn định trong vòng vài ngày, sau đó bắt đầu giảm (bảng 3.19)
Bảng 3.19: Thời gian lên men thích hợp
Thời gian (ngày) CFU/g chế phẩm
1 4,3.108
2 5,8.109
4 6,6.109
6 5,4.108
8 1,2.107
Lên men Bacillus trên môi trường xốp
Tƣơng tự nhƣ lên men chìm đối với vi khuẩn Bacillus, để nhận đƣợc chế phẩm lên men đảm bảo chất lƣợng, một số điều kiện lên men cơ bản cần đƣợc khảo sát: thành phần môi trƣờng lên men, nhiệt độ lên men, tỷ lệ giống bổ sung và thời gian lên men.
Thành phần lên men Bacillus trên môi trƣờng xốp đƣợc nghiên cứu bao gồm bột sắn, bột đậu tƣơng, bột gạo, bột cám và đƣờng tỷ lệ khác nhau. Qua nghiên cứu thấy rằng: có thể sử dụng môi trƣờng chứa đậu tƣơng, bột gạo, bột cám để len men, đạt chất lƣợng: 1,07.109
CFU/g chế phẩm lên men hoặc môi trƣờng chỉ có bột gạo, bột cám cũng đạt chất lƣợng tƣơng đƣơng: 1,2.109
CFU (bảng 3.20).
Nhƣ vậy, môi trƣờng có bột cám tạo độ xốp, lƣợng không khí nhiều hơn vì vậy lên men có hiệu quả hơn.
Bảng 3.20: Thành phần lên men Bacillus trên môi trƣờng xốp
STT Thành phần B.licheniformis G1 B.subtilis DA B.megaterium PA
1 Bột đậu, bột sắn 1,7.108 2,2.108 1,8.108 2 Bột đậu, bột gạo 2.108 6,8.108 1,2.108 3 Bột đậu, bột cám 2,07.108 3,7.108 3.108 4 Bột gạo, bột cám 1,11.109 1,2.109 1.108 5 Bột đậu, bột gạo, bột cám 6,1.10 8 2,3.109 1,1.109
Ảnh hƣởng của nguồn cacbon (đƣờng) đến quá trình lên men trên môi trƣờng xốp cũng đƣợc nghiên cứu trên 4 loại đƣờng thông dụng: sucrose, glucose, lactose và maltose đƣợc sử dụng để len men. Kết quả cho thấy các chủng Bacillus nghiên cứu hầu nhƣ không sử dụng hoặc sử dụng đƣờng sucrose, maltose kém, đối với đƣờng glucose, lactose kết quả không chênh lệch nhiều (Bảng 3.21)
Bảng 3.21: Ảnh hƣởng nguồn cacbon đến quá trình lên men Bacillus trên môi trƣờng xốp
STT Thành phần B.licheniformis G1 B.subtilis DA B.megaterium PA
1 Sucrose 1,2.108 2,1.108 1,1.108 2 Glucose 3.108 6,6.108 2.5.108 3 Lactose 2,34.108 4,3.108 3.108 4 Maltose 1,11.108 1,6.108 1.108
Lên men Bacillus trên môi trƣờng xốp đƣợc tiến hành ở nhiệt độ 28, 30, 34 và 370C. Kết quả nhận thấy nhiệt độ hầu nhƣ không ảnh hƣởng đến quá trình lên men trên môi trƣờng xốp. Có thể lên men trên môi trƣờng xốp ở nhiệt độ từ 28-370C (bảng 3.22).
Bảng 3.22: Nhiệt độ lên men Bacillus trên môi trƣờng xốp STT Nhiệt độ (0C) B.licheniformis G1 B.subtilis DA B.megaterium PA 1 28 3,2.108 9,48.108 4,1.108 2 30 4,5.108 1,8.109 2.5.108 3 34 3,34.108 1,56.109 3.108 4 37 2,11.108 1,46.109 1.108
Lên men Bacillus trên môi trƣờng xốp thực hiện với tỷ lệ giống: 20, 25, 30 và 35%. Có thể bổ sung giống với tỷ lệ 25-30% (Bảng 3.23)
Bảng 3.23: Tỷ lệ giống lên men Bacillus trên môi trường xốp
STT Tỷ lệ giống B.licheniformis G1 B.subtilis DA B.megaterium PA
1 20 3,1.108 4,3.108 1,8.108 2 25 4,2.108 5,8.109 1,5.109 3 30 2,5.108 6,6.109 9,5.108 4 35 1,3.106 5,4.107 7,5.107
Thời gian lên men thích hợp cũng đƣợc theo dõi. Đối với lên men chìm, sau 24 giờ có thể thu hồi sinh khối nhƣng trên môi trƣờng xốp, thời gian để vi khuẩn làm quen với môi trƣờng dài hơn, do vậy, lên men với thời gian lâu hơn. Thời gian lên men Bacillus trên môi trƣờng xốp đƣợc nghiên cứu sau 1, 2, 4, 6, 8 ngày. Sau 2 ngày theo dõi thấy màu của môi trƣờng thay đổi, vàng hơn và có mùi thơm. Trong thời gian 2-4 ngày đạt số lƣợng tế bào cao nhất và giảm sang ngày thứ 6 (Bảng 3.24)
Bảng 3.24: Thời gian lên men Bacillus trên môi trƣờng xốp thích hợp
STT Thời gian lên men (ngày) B.licheniformis G1 B.subtilis DA B.megaterium PA 1 1 6,3.107 9,2.107 3,2.107 2 2 7,2.107 2,2.108 1,2.108 3 4 2,5.108 1,5.109 1,5.108 4 6 1,2.108 1,2.109 1,3.108 5 8 1,7.107 1,8.108 1,1.107
Từ kết quả nghiên cứu lên men trên môi trƣờng xốp các chủng vi khuẩn. Chúng tôi đã lựa chọn sử dụng 2 chủng vi khuẩn B.subtilis DA, L.acidophillus TN cho việc sản xuất chế phẩm.
Nhƣ vậy, để len men vi sinh tạo chế phẩm sinh học sử lý môi trƣờng nƣớc nuôi trồng thủy sản,chúng tôi tiến hành cả hai phƣơng pháp lên men chìm và lên men trên môi trƣờng xốp.
Chế phẩm dạng dịch tiến hành lên men chìm, lựa chọn các chủng
L.acidophilus TN, B.subtilis DA và R.palustris RD.
Chế phẩm dạng bột đƣợc tạo ra bằng phƣơng pháp lên men trên môi trƣờng xốp 2 chủng đƣợc lựa chọn là L.acidophilus TN và B.subtilis DA
Chất lƣợng chế phẩm lên men đạt từ 108
-109 CFU trong 1 ml hoặc 1 g. Quy trình lên men tạo chế phẩm đƣợc tóm tắt trong sơ đồ hình 3.4:
-
Sơ đồ quy trình lên men chìm và lên men trên môi trƣờng xốp
Giống R. palustris RD
Nhân giống
Lên men chìm
Thu hồi sinh khối
Kiểm tra chất lƣợng
Lên men trên mt xốp
Giống B. subtilis DA Giống L.acidophillus TN
R. palustris RD Nuôi tĩnh, 6 ngày, 300C, chiếu sáng B.subtilis DA Sục khí, 48 giờ, 370C, khuấy 500v/p L.acidophillus TN Nuôi tĩnh, 24 ngày, 340C B.subtilis DA 25-30% giống 370C, 72 giờ L.acidophillus TN 25-30% giống 340C, 72 giờ
3.3. Kết quả nghiên cứu kỹ thuật thu hồi sinh khối tạo chế phẩm và bảo quản chế phẩm