3. Nội dung nghiên cứu
2.2. Hóa chất và thiết bị sử dụng
2.2.1. Hóa chất
Glucoza, MgSO4.7H2O; NaCl; K2HPO4; CaCO3; FeCl3.6H2O; Pepton; Cao nấm men; cao malt; Tween 80; Cao thịt; KI, I2 các hóa chất khác của hãng Merck, Sigma,... do công ty cổ phần hóa chất Á Châu ( Tên viết tắt là ACC), địa chỉ 364 Cộng Hòa – 13 Tân Bình – Hồ Chí Minh cung cấp.
2.2.2. Thiết bị
Các máy móc, dụng cụ đƣợc sử dụng có tại phòng thí nghiệm công ty thuốc thú y Marphavet. Địa chỉ tại Thanh Tân – Trung Thành – Phổ Yên – Thái Nguyên. Đây là công ty sản xuất thuốc thú y có phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn của tổ chức y tế thế giới WHO – GLP ( Good laboratory practice) cấp năm 2011. Bao gồm:
TT Tên thiết bị model Nhà sản xuất
1 Hệ thống lên men sục khí D21000854 Sartorius – Đức 2 Cân phân tích điện tử 10-4
g (220g) XB 220A Precisa - Thụy Sỹ 3 Cân kỹ thuật điện tử (620mg) BL 620S Shimadzu - Nhật Bản 4 Máy đo pH HM - 25R Toa DKK - Nhật Bản 5 Máy phân tích độ ẩm XM 60 Precisa - Thụy Sỹ 6 Tủ cấy vi sinh ACB-4A1 Sesco/Singapore 7 Tủ sấy DX-402 Yamato - Nhật Bản 8 Tủ ấm IC 402 Yamato - Nhật Bản 9 Nồi hấp tiệt trùng SQ-510 Yamato - Nhật Bản 10 Máy khuấy từ gia nhiệt MST- digital IAK - Đức
2.3. Môi trƣờng nghiên cứu 2.3.1. Môi trƣờng MRS (g/l) 2.3.1. Môi trƣờng MRS (g/l)
Đƣờng Glucose 20,0 K2HPO4 2,0
CaCO3 5,0 CH3COONa 5,0
Cao thịt 10,0 Triamoni xitrat 2,0 Pepton 10,0 MgSO4.7H2O 0,58 Cao nấm men 5,0 MnSO4.4H2O 0,28 Tween 80 1 ml Nƣớc cất vừa đủ 1000 ml pH = 7,0; khử trùng 1210
C/15 phút Agar 15,0 Môi trƣờng dịch thể bỏ agar và CaCO3
2.3.2. Môi trƣờng SA (g/l)
Sodium acetate 1 NaCl 0,2 Sodium succinate 1 CaCl2.2H2O 0,05 KH2PO4 0,5 Na2S2O3.5H2O 0,1 K2HPO4 0,6 Cao nấm men 0,1 (NH4)2SO4 1 Hỗn hợp vitamin 1 ml MgSO4.7H2O 0,2 Dung dịch vi lƣợng 1 ml Nƣớc cất vừa đủ 1000 ml Agar 15 pH = 6,,8-7,0.Tiệt trùng 1210C/15 phút Môi trƣờng dịch thể bỏ agar
2.3.3. Môi trƣờng MPA (g/l) Cao thịt 5 NaCl 5 Cao thịt 5 NaCl 5 Pepton 10 Agar 15 pH = 6,8 – 7,0 Nƣớc cất vừa đủ 1000 ml Tiệt trùng 1210 C/15 phút Môi trƣờng dịch thể bỏ agar
2.3.4. Dung dịch vi lƣợng (g/l) EDTA-2Na 1 CoCl2.6H2O 20 mg EDTA-2Na 1 CoCl2.6H2O 20 mg FeCl3 2 Na2MO4.2H2O 10 mg ZnCl2 0,1 CuCl2.2H2O 10 mg MnCl2 0,1 Na2SeO3 5 mg H3BO3 0,1 Nƣớc cất 1000 ml 2.3.5. Hỗn hợp vitamin (mg/ml) Thiamin – HCl 50 Biotin 5,0 Niacin 50 Vitamin B12 5,0 p-aminobenzoic acid 30 Nƣớc cất vừa đủ 100 ml Pyridoxal- HCl 10 2.3.5. Môi trƣờng CMC (g/l) (NH4)2SO4 1 CMC 10 K2HPO4 1 agar 20 MgSO4.7H2O 0.5 Nƣớc cất vừa đủ 1000 ml NaCl 0.001 pH 7
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu và xác định các chỉ tiêu nghiên cứu
2.4.1. Phƣơng pháp lựa chọn chủng vi khuẩn sử dụng để sản xuất chế phẩm sinh học - Khả năng chịu mặn: Môi trƣờng sử dụng để kiểm tra khả năng chịu mặn - Khả năng chịu mặn: Môi trƣờng sử dụng để kiểm tra khả năng chịu mặn là môi trƣờng MPA đối với Bacillus; MRS đối với L.acidophillus TN và SA đối với R.palustris RD, có bổ sung NaCl với nồng độ 1%, 3%, 5%, 7%, 10%. Đánh giá sự phát triển của vi khuẩn sau 48 giờ nuôi cấy. Các mẫu thí nghiệm đều phân tích so với đối chứng có nồng độ muối tƣơng ứng. Phân tích mật độ vi khuẩn trong dịch nuôi bằng cách đếm trên đĩa thạch theo phƣơng pháp của Koch và thông qua chỉ số mật độ quang (OD660).
- Khả năng đối kháng: Kiểm tra với Vibrio parahaemolticus (Vp), Vibrio fuonisi (Vf) trên đĩa môi trƣờng thạch đĩa MPA (Bacillus); MRS (L.acidophillus
TN). Các chủng cần kiểm tra cấy chấm điểm vào đĩa thạch đã bổ sung Vp, Vf. Quan sát vòng kháng khuẩn sau 24 – 48 giờ.
- Khả năng sinh protease [4]: Kiểm tra trên môi trƣờng MPA (Bacillus); MRS (L.acidophillus TN) có bổ sung 10% sữa đã đƣợc tách béo và thanh trùng. Cấy chủng và quan sát vòng thủy phân xung quanh khuẩn lạc.
- Khả năng sinh amylase [4]: cấy chủng Bacillus và L.acidophillus TN
trên môi trƣờng có bổ xung tinh bột. Sau khi vi khuẩn phát triển, nhỏ dung dịch Lugol, quan sát vòng thủy phân tinh bột xung quanh khuẩn lạc.
- Khả năng sinh cellulase [4]: Trên môi trƣờng chứa CMC, vi khuẩn sẽ tiết ra cellulase ngoại bào phân hủy cơ chất để sinh trƣởng và làm cho môi trƣờng trong hơn khi nhuộm bằng thuốc thử Lugol. Độ lớn của khoảng môi trƣờng trong suốt và vệt cấy phản ánh khả năng sinh trƣờng phát triển và phân giải CMC của vi khuẩn.
- Khả năng sinh trƣởng trong các nguồn nƣớc thải: Sử dụng nƣớc thải ở một số vùng có hàm lƣợng chất hữu cơ cao: nƣớc thải chăn nuôi, nƣớc thải kênh ô nhiễm, nƣớc thải làng nghề sản xuất bún. Các nguồn nƣớc thải sau khi đƣợc khử trùng đƣợc sử dụng làm môi trƣờng để nuôi cấy chủng R.palustris RD. Thí nghiệm đƣợc tiến hành trong điều kiện kị khí và chiếu sáng. Theo dõi mức độ tích lũy sinh khối của chủng nuôi cấy sau một tuần thông qua chỉ số mật độ quang (OD660).
- Kiểm tra độ an toàn của các chủng nghiên cứu: Thử độc tính cấp trên chuột nhắt trắng đƣợc tiến hành trên 50 con chia làm 5 nhóm, nhóm đối chứng dùng nƣớc cất và 4 nhóm thử mẫu với liều khác nhau. Các mức liều cao uống 2- 3 lần/ ngày, cách nhau 3 giờ. Theo dõi chuột 5 ngày sau khi cho uống.
2.4.2. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nhân giống
- Ảnh hƣởng của tỷ lệ giống: Bổ sung giống với tỷ lệ 5%, 7,5%, 10%, theo dõi sự sinh trƣởng và phát triển qua xác định OD660nm, CFU/ml
- Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng: Điều chỉnh pH môi trƣờng đạt 5,5; 6; 6,5 đối với vi khuẩn L.acidophillus TN. Xác định pH môi trƣờng sau khi nuôi cấy, OD620nm, CFU/ml.
- Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến tích lũy sinh khối: Khảo sát khả năng sinh trƣởng và phát triển của R.palustris RD trên môi trƣờng SA lỏng, điều kiện kị khí, chiếu sáng, ủ ở các khoảng nhiệt độ: 20, 25, 30, 35, 40, 45 và 500
C.
- Ảnh hƣởng của thời gian nhân giống: Khả năng sinh trƣởng và phát triển của Bacillus, L.acidophillus TN, R.palustris RD sau 16, 20, 24, 36, 48 giờ đƣợc theo dõi qua xác định pH, OD660nm, CFU/ml
2.4.3. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men
- Thành phần lên men chìm Bacillus, L.acidophillus TN, R.palustris RD
thích hợp đƣợc lựa chọn trên cơ sở môi trƣờng nhân giống Bacillus, có thay đổi một số thành phần phù hợp, dễ kiếm, rẻ tiền. Xác định CFU/ml dịch lên men bằng cách phân tích mật độ vi khuẩn trong dịch nuôi bằng cách đếm trên đĩa thạch theo phƣơng pháp của Koch.
- Thời gian lên men Bacillus, L.acidophillus TN, R.palustris RD thích hợp đƣợc nghiên cứu qua theo dõi xác định OD660nm, CFU/ml dịch lên men
- Xác định thành phần lên men L.acidophillus TN trên môi trƣờng xốp thích hợp bằng cách lên men trên cơ chất là nguồn cacbon ( đƣờng sucrose, lactose, glucose, maltose, mannitol); chất mang; bột đậu tƣơng, bột gạo, bột sắn, bột cám với tỷ lệ khác nhau. Xác định CFU/gam chế phẩm lên men.
- Xác định thành phần lên men Bacillus trên môi trƣờng xốp trên nguồn cơ chất bao gồm: đậu tƣơng, bột gạo, bột cám. Xác định CFU/gam chế phẩm lên men.
- Tỷ lệ giống thích hợp để lên men Bacillus trên môi trƣờng xốp đƣợc nghiên cứu: 20%, 25%, 30%, 35%. Xác định CFU/ gam chế phẩm lên men.
- Nhiệt độ lên men Bacillus, L.acidophillus TN trên môi trƣờng xốp thích hợp đƣợc nghiên cứu: 280
C, 300C, 340C, 370C. Xác định CFU/ gam chế phẩm lên men.
- Xác định thời gian lên men Bacillus, L.acidophillus TN trên môi trƣờng xốp thích hợp bằng cách lên men 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8 ngày, xác định CFU/ gam chế phẩm lên men
Thu hồi sinh khối tạo chế phẩm và bảo quản chế phẩm
- Tạo chế phẩm dạng lỏng: Dịch lên men Bacillus đã đƣợc thu hồi, bổ sung L.acidophillus TN và R.palustris RD cũng đƣợc thu hồi và cho thêm chất bảo quản. Kiểm tra độ tinh khiết, chất lƣợng ( CFU/ml chế phẩm: 108
).
- Tạo chế phẩm dạng bột: Chế phẩm lên men Bacillus đã đƣợc sấy khô với nhiệt độ 50, 60, 65, 700C, nghiền, bổ sung chế phẩm lên men L.acidophillus TN cũng đƣợc sấy khô, nghiền nhỏ. Kiểm tra độ tinh khiết, chất lƣợng (CFU/gam chế phẩm: 108
)
- Thành lập công thức bảo quản chế phẩm dạng bột gồm: Bacillus, L.acidophillus TN thêm một số thành phần sau: bột, sucrose, lactose, Na2CO3. Theo dõi độ ổn định 3, 6, 12 tháng.
- Thành lập công thức bảo quản chế phẩm dạng lỏng với các thành phần bảo quản: sucrose; Lactose, Na2S2O3 + Lactose. Theo dõi độ ổn định 3, 6, 12 tháng.
2.4.4. Phƣơng pháp định tính vi khuẩn nghiên cứu
Định tính vi khuẩn Bacillus, L.acidophillus TN, R.palustris RD dựa trên nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, bào tử, đặc điểm sinh hóa [12, 18, 19, 21].
- Xác định đặc điểm khuẩn lạc: Quan sát đặc điểm khuẩn lạc của Bacillus
trên môi trƣờng MPA; L.acidophillus TN trên môi trƣờng MRS và của
R.palustris RD trên môi trƣờng SA bổ sung agar. Cấy các vi khuẩn trên môi trƣờng thích hợp, nuôi 24-48h. Chọn những đĩa thạch có khuẩn mọc riêng rẽ để quan sát.
- Xác định hình thái tế bào, bào tử: Có thể sử dụng môi trƣờng lỏng hay môi trƣởng thạch để quan sát đặc điểm hình thái tế bào, bào tử. Vi khuẩn sau khi đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng thích hợp, làm tiêu bản, nhuộm Gram. Quan sát
hình dạng tế bào, cách sắp xếp, bào tử trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần.
- Khả năng sinh enzyme catalase: Sử dụng môi trƣờng MRS đối với
L.acidophillus TN và môi trƣờng MPA với Bacillus. Vi khuẩn sau khi nuôi cấy, hòa thành hỗn dịch với 1 giọt nƣớc oxy già (3-5% H2O2). Vi khuẩn sinh catalase tạo thành bọt khí.
- Khả năng lên men đƣờng sinh axit: sử dụng môi trƣờng thạch bán lỏng MRS đối với L.acidophillus TN và môi trƣờng MPA với Bacillus, bổ sung đƣờng sucrose, mannose, bổ sung chất chỉ thị màu ( xanh metylen), cho vào ống nghiệm, khử trùng. Cấy vi khuẩn cần xác định lên môi trƣờng, nuôi 5 ngày. Quan sát sự phát triển và sự chuyển màu của môi trƣờng.
- Lên men làm đông sữa, sinh axit: Môi trƣờng để xác định gồm sữa ông thọ 30%. Sữa đƣợc thanh trùng, để nguội. Cấy vi khuẩn cần xác định. Nuôi 24- 48h. Quan sát mức độ đông, mùi, vị sữa lên men.
- Khả năng sử dụng sulfua của chủng R.palustris RD: nuôi cấy chủng trong môi trƣờng có chứa Na2S với hàm lƣợng 2mM ( tƣơng đƣơng 64mgD/L). Thí nghiệm tiến hành trong điều kiện kị khí, chiếu sáng. Xác định hàm lƣợng sulfua còn lại trong môi trƣờng sau 5 ngày nuôi cấy.
Phương pháp xác định độ tinh khiết của chế phẩm:
- Độ tinh khiết của chế phẩm đƣợc xác định trên môi trƣờng MRS đối với
L.acidophillus TN; môi trƣờng MPA với Bacillus và môi trƣờng SA với
R.palustris RD. Chế phẩm chỉ bao gồm những vi khuẩn nghiên cứu.
Phương pháp định lượng
- Xác định số lƣợng tế bào vi khuẩn trong 1g ( 1ml) chế phẩm trên môi trƣờng MRS đối với L.acidophillus TN; MPA với Bacillus và T với R.palustris RD. Cân 1g hoặc hút 1ml chế phẩm vào bình nón chứa NaCl 0,9%. Hòa loãng chế phẩm để đạt đƣợc những nồng độ pha loãng 10-4
, 10-5. Nuôi và đếm số khuẩn lạc ở các đĩa petri có số khuẩn lạc <100. Tính số CFU/ml(g) theo công thức:
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu tuyển chọn giống sản xuất
3.1.1. Chọn chủng có hoạt tính sinh học ổn định, an toàn với vật nuôi
Việc thƣờng xuyên chọn chủng vi sinh vật mang những đặc tính cần thiết, sử dụng để sản xuất chế phẩm xử lý môi trƣờng nuôi trồng thủy sản đƣợc cho là khâu quan trọng trong quy trình sản xuất chế phẩm. Tiêu chí đặt ra để tuyển chọn chủng là sinh enzym phân hủy hữu cơ, đối kháng với Vibrio, chịu mặn và đảm bảo an toàn cho vật nuôi.
Đối kháng với vi khuẩn gây bệnh tôm, cá
Vibrio và vi khuẩn gây bệnh cơ hội, trong điều kiện môi trƣờng bị ô nhiễm, Vibrio gây ra một số bệnh cho tôm nhƣ bệnh phát sáng, bệnh mòn đuôi, cụt râu, bệnh phân trắng... kiểm tra khả năng đối kháng với Vibrio fuosini (V.f)
và Vibrio parahaemolyticus (V.p) của 4 chủng đang sử dụng, thấy rằng
L.acidophillus TN ức chế mạnh sự phát triển của vi khuẩn V.fuosini và
V.parahaemolyticus (bảng 3.1). Ngoài ra, B.lichenniformis G1 cũng ức chế sự phát triển của vi khuẩn V.f và V.p, nhƣng yếu hơn L.acidophillus TN
Bảng 3.1. Kiểm tra khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh tôm cá
Chủng vi sinh vật Khả năng đối kháng
Vibrio fuosini Vibrio parahaemolyticus
L.acidophillus TN +++ +++
B.licheniformis G1 + +
B.subtilis DA - -
B.megaterium PA + -
Hoạt tính phân hủy hữu cơ
Khả năng phân hủy hữu cơ, làm sạch môi trƣờng nhờ sinh enzym phân hủy hữu cơ nhƣ protease phân hủy protein, amylase phân hủy tinh bột, cellulase phân hủy cellulose, chủ yếu xuất hiện ở nhóm vi khuẩn hoại sinh có bào tử thuộc chi Bacillus. Khả năng sinh enzym phân hủy hữu cơ là một trong những tiêu chí quan trọng để tuyển chọn chủng phục vụ cho việc sản xuất chế phẩm xử lý môi trƣờng nuôi trồng thủy sản. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.2
Bảng 3.2. Khả năng sinh enzym phân hủy hữu cơ của vi khuẩn
Chủng vi sinh vật Protease Amylase Cellulose
L.acidophillus TN - - -
B.licheniformis G1 ++ ++ ++
B.subtilis DA ++ ++ ++
B.megaterium PA ++ - -
Chú thích: -: không sinh enzym, ++: có sinh enzym
Ba chủng Bacillus trong thử nghiệm đều có khả năng sinh enzyme phân hủy hữu cơ. Tuy nhiên, chỉ có B.licheniformis G1 và B.subtilis DA có khả năng sản sinh ra enzyme phân hủy đƣợc cả 3 loại chất hữu cơ là Protease, Amylase và Cellulose.
Khả năng chịu mặn
Hầu hết diện tích nuôi tôm sú đều nằm trong vùng nƣớc lợ hoặc nƣớc mặn. Bởi vậy, việc chọn những chủng vi khuẩn có khả năng chịu mặn cao để tồn tại và sinh trƣởng trong môi trƣờng có độ muối cao đƣợc nghiên cứu. Khả năng chịu mặn của 5 chủng vi khuẩn sử dụng đều có khả năng chịu đƣợc 5% NaCl, trong khi độ mặn của môi trƣờng nuôi chỉ dƣới 3%. Riêng 3 chủng
B.megaterium PA và B.subtilis DA chịu đƣợc 10% NaCl ( hình 3.1).
Hình 3.1: Khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn
TN: L.acidophillus TN; G1: B.licheniformis G1; DA: B.subtilis; PA: B.megaterium PA; RD: R.palustris RD
NaCl OD
Khả năng sinh trưởng trong các nguồn nước thải
Theo dõi mức độ tích lũy sinh khối của chủng vi khuẩn tía
Rhodopseudomonas palustris trong các nguồn nƣớc thải sau một tuần cho thấy:
Rhodopseudomonas palustris có khả năng sinh trƣởng trong các môi trƣờng nƣớc thải thử nghiệm, với các mức độ tích lũy sinh khối khác nhau. Sự tích lũy sinh khối của Rhodopseudomonas palustris đƣợc trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3: Khả năng sinh trƣởng (theo tích lũy sinh khối OD660) của chủng vi khuẩn tía Rhodopseudomonas palustris trong các nguồn nƣớc thải
Nƣớc thải Chủng Nƣớc thải sản xuất bún Nƣớc thải chăn nuôi Nƣớc kênh ô nhiễm Rh. palustris RD 1.26 3.02 1.18
Kết quả thu đƣợc cho thấy chủng vi khuẩn tía Rhodopseudomonas palustris có khả năng sinh trƣởng tốt trong môi trƣởng nƣớc thải chăn nuôi và vẫn sinh trƣởng bình thƣờng trong môi trƣờng nƣớc thải ô nhiễm có nguồn hữu cơ thấp. Nhƣ vậy, việc tích lũy sinh khối của vi khuẩn Rhodopseudomonas palustris từ nguồn hữu cơ trong nƣớc thải là một trong những yếu tố đóng vai trò làm sạch nguồn nƣớc thải chăn nuôi.
Từ kết các kết quả nghiên cứu cho thấy các chủng vi khuẩn lựa chọn có đầy đủ những đặc tính sinh học phù hợp, đáp ứng các chỉ tiêu của chủng giống dùng để sản xuất chế phẩm sinh học.
Cả 03 chủng vi khuẩn Bacillus đều có hoạt lực enzyme phân hủy hữu cơ: amylase, protease, cellulase đáng kể. Vì thế chúng có khả năng phân hủy nhanh