3. Nội dung nghiên cứu
3.1.2.Xác định điều kiện nhân giống
Điều kiện nhân giống Bacillus
Một trong những mục tiêu đặt ra là sản xuất giống đảm bảo chất lƣợng. Trong đó, thành phần môi trƣờng nhân giống là yếu tố quan trọng nhất, ảnh hƣởng đến chất lƣợng giống trong quá trình sản xuất. Bằng việc bổ sung thêm một số thành phần với liều lƣợng thích hợp vào môi trƣờng nuôi cấy thông qua các chủng vi khuẩn Bacillus (môi trƣờng MPA3), đã nhận đƣợc môi trƣờng thích hợp, tăng mật độ tế bào trong 1ml giống từ 108
đến 109 (Bảng 3.4).
Bảng 3.4: Thành phần môi trƣờng nhân giống Bacillus thích hợp Ký hiệu
MT Thành phần CFU/ml
G1 DA PA
MPA 1 Pepton, cao thịt, NaCl 2,6.108 2,12.108 1,15.108 MPA 2 Pepton, cao thịt, cao men, NaCl 3.108 2,4.108 2,7.108 MPA 3 Pepton, cao men, NaCl, MgSO4,
(NH4)2SO4
2,1.109 6,1.109 1,01.109
Nhiệt độ cũng là một trong những yếu tố cần quan tâm trong quá trình nhân giống, Bacillus đƣợc nhân giống ở nhiệt độ 280C, 300C, 340C, 370C, thấy rằng có thể nhân giống Bacillus ở nhiệt độ nhân giống từ 280C-370C (Bảng 3.5), rất thuận lợi cho việc triển khai nhân giống tại cơ sở sản xuất.
Bảng 3.5: Nhiệt độ nhân giống Bacillus thích hợp
Nhiệt độ (0C)
B.licheniformis G1 B.subtilis DA B.megaterium PA
CFU/ml OD660 pH CFU/ml OD660 pH CFU/ml OD660nm pH
28 7,2.108 2,73 7,7 8,7.108 2,67 8,7 3,7.108 2,76 8,7
30 8,7.108 2,90 8,0 2.109 2,77 8,8 1,11.109 3,11 8,8
34 3.02.109 3,01 8,5 4.07.109 2,98 9,7 8,8.108 2,91 9,5
37 2,02.109 2,96 8,2 4,11.109 2,9 8,8 7,4.108 2,06 8,1
Tỷ lệ giống thích hợp để nhân giống cũng đƣợc khảo sát và thấy rằng có thể sử dụng giống Bacillus theo tỷ lệ 5-10% (Bảng 3.6).
Bảng 3.6: Tỷ lệ giống thích hợp Tỷ lệ giống (%) CFU/ml G1 DA PA 5 6,6.108 9,12.108 1,15.108 7,5 1,08.109 4,4.109 2,7.109 10 2,1.109 6,6.109 3,1.109
Môi trƣờng và điều kiện tối ƣu để nhân giống Bacillus là môi trƣờng MPA 3 (Pepton, cao men, NaCl, MgSO4, (NH4)2SO4); Nhiệt độ thích hợp để nhân giống là 340
C-370C; tỷ lệ giống từ 7,5%
Điều kiện nhân giống Lactobacillus acidophillus TN
Tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến chất lƣợng giống
L.acidophillus TN nhƣ thành phần môi trƣờng, nhiệt độ, pH, môi trƣờng nhân giống, tỷ lệ giống đƣợc nghiên cứu. Kết quả đƣợc trình bày ở Bảng 3.7, 3.8 3.9, 3.10.
Bảng 3.7: Thành phần môi trƣờng nhân giống L.acidophillus TN thích hợp
MT Thành phần Đánh giá sự phát triển
CFU/ml OD660nm pH
MRS Cao thịt,pepton, glucose, cao men, khoáng 4,5.108 3,69 3,22 NB Cao thịt, pepton, muối khoáng 5,1.106 0,98 5,81 CC Pepton, glucose, nƣớc chiết cà chua 5,6.107 1,92 4,7 BC Pepton, glucose, nƣớc chiết bắp cải 3,4.107 1,77 4,5
Bảng 3.8: Nhiệt độ nhân giống Lactobacillus acidophillus TN thích hợp
Nhiệt độ (0 C) Đánh giá sự phát triển CFU/ml OD660nm pH 28 3,7.108 2,85 4,05 30 1,05.109 3,0 3,81 34 2,1.109 3,1 6,69 37 7,0.108 2,2 8,8
Bảng 3.9: pH môi trƣờng nhân giống L.acidophillus TN thích hợp
pH MT đầu Đánh giá sự phát triển CFU/ml OD660nm pH 5,5 1,4.108 2,61 4,37 6 4,2.109 3,1 3,4 6,5 1,8.109 2,8 3,6
Bảng 3.10: Tỷ lệ giống L.acidophillus TN thích hợp
Tỷ lệ giống (%) Đánh giá sự phát triển
CFU/ml OD660nm pH
5 2,2.108 3,19 3,95
7,5 2,8.109 3,22 3,92
10 3,7.109 3,25 3,91
Từ kết quả nghiên cứu trên chúng tôi nhận thấy môi trƣờng và điều kiện thích hợp để nhân giống L.acidophillus TN là môi trƣờng MRS (cao thịt, pepton, glucose, cao men, muối khoáng); nhân giống ở nhiệt độ 340C; pH môi trƣờng trƣớc khi nhân giống bằng 6; có thể sử dụng tỷ lệ giống từ 5-10%
Quy trình nhân giống Rhodopseudomonas palustris RD
Nhu cầu vitamin, pH môi trƣờng và nhiệt độ nuôi cấy là những yếu tố chủ yếu ảnh hƣởng trực tiếp đến sự tăng trƣởng của chủng vi khuẩn tía không lƣu huỳnh R.palustris RD. Sử dụng kết quả các thí nghiệm để tìm ra điều kiện nuôi cấy tối ƣu cho việc nhân giống R.palustris RD (bảng 3.11, 3.12).
Để xác định nhu cầu vitamin của chủng R.palustris RD tiến hành nuôi trong môi trƣờng khuyết thiếu một trong sáu loại vitamin, kí hiệu: khuyết thiamin (-t), khuyết niacin (-n), khuyết p-aminobenzoic acid (-p), khuyết pyridoxal – HCl (-HCl), khuyết biotin (-b), khuyết vitamin B12 (-B12)
Bảng 3.11: Nhu cầu vitamin của Rhodopseudomonas palustris RD
vitamin
Chủng -b -p -t -n -HCl -B12
R.palustris RD - - + + + +
Chú thích: -: không sinh trưởng; +: có sinh trưởng
Bảng 3.12: Khả năng sinh trƣởng của R.palustris RD trong các khoảng pH pH
Chủng 5,5 6,0 7,0 8,0 8,5 9,0
Rh.palustris RD - ++ +++ +++ ++ -
Chú thích: -: không sinh trưởng, +: sinh trưởng yếu, ++: sinh trưởng trung bình, +++: sinh trưởng mạnh
Khi nhân giống R.palustris RD ngoài tự nhiên, nhiệt độ là một trong những điều kiện quan trọng ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển. Mức độ ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự tích lũy sinh khối đƣợc thể hiện trong đồ thị:
Hình 3.2: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sinh trƣởng của R.palustris RD Kết quả thử nghiệm cho thấy R.palustris RD có nhu cầu vitamin cần biotin, p-aminobenzoic acid. Không đòi hỏi có thiamin, pyridoxal –HCl, B12 và niacin. Khoảng pH sinh trƣởng tốt từ 6-8,5. Nhiệt độ nuôi cấy trong khoảng 250C-300C.
Từ các kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi tóm tắt trong sơ đồ quy trình nhân giống (hình 3.3).
0 C
Hình 3.3: Sơ đồ quy trình nhân giống