3. Nội dung nghiên cứu
3.2.Kết quả nghiên cứu quy trình lên men sản xuất chế phẩm
3.2.1. Lên men chìm
Trong vài năm gần đây, ở các tỉnh phía Bắc do điều kiện thời tiết không đƣợc thuận lợi, mƣa bão thất thƣờng xảy ra nên những ngƣời nuôi tôm sú phải chịu nhiều rủi ro, thiệt hại về kinh tế. Mặc dù nghê nuôi tôm sú mang lại lợi nhuận cao hơn nhiều so với nuôi tôm nƣớc ngọt (tôm càng xanh) hay nuôi cá. Song một số ngƣời đã chuyển dần sang nuôi tôm nƣớc ngọt để giảm bớt rủi ro. Trƣớc thực trạng đó, việc đƣa ra loại chế phẩm giá thành hạ, phù hợp cho cả đối tƣợng nuôi nƣớc ngọt và nƣớc lợ là cần thiết.
Việc áp dụng hệ thống lên men sục khí trong sản xuất chế phẩm sinh học là một bƣớc tiến quan trọng nhằm gia tăng chất lƣợng của chế phẩm trong quá trình sử dụng. Tuy vậy, để sử dụng hệ thông lên men hiệu quả cần phải đặc biệt chú ý đến những yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men.
Kiểm tra tinh khiết
300C/ 48h. tĩnh
Hoạt hóa
Nhân giống cấp 1
Kiểm tra tinh khiết Kiểm tra tinh khiết
Nhân giống cấp 2 340C/ 24h. tĩnh 370C/ 24h. lắc 200v/p Giống cấp 3 370C/ 24h. lắc 200v/p 300C/ 48h. tĩnh, chiếu sáng 340C/ 24h. tĩnh
Đối với vi khuẩn Bacillus, độ thông khí có ý nghĩa quan trọng đối với quá trình lên men tạo sinh khối. Nhƣng ngƣợc lại, đối với L.acidophillus TN và
R.palustris RD chúng phát triển tốt trong điều kiện kém độ thông khí. Mặt khác, đối với việc sản xuất, bên cạnh mối quan tâm về sự phát triển của vi khuẩn, chất lƣợng và số lƣợng của từng mẻ lên men cũng rất quan trọng. Tiến hành khảo sát để làm sáng tỏ hai mục đích trên. Kết quả cho thấy: trong điều kiện lên men, có khuấy đối với L.acidophillus TN và không khuấy với R.palustris RD độ thông khí đƣợc quan sát bằng thể tích môi trƣờng/ thể tích bình (Vmt/Vb) lần lƣợt là: 12 lít/ 20 lít và 16 lít/ 20 lít là tối ƣu nhất. Nhƣng đối với Bacillus trong điều kiện lên men sục khí lƣợng Oxi cung cấp vào tối ƣu là 130%, lƣợng môi trƣờng nhân giống bình nhỏ là 10 lít/ 12 lít và 80 lít/ 120 lít.
Bảng 3.13: Xác định độ thông khí trong bình lên men L.acidophillus TN và
R.palustris RD
Độ thông khí Vmt/Vb (lít)
Lactobacilus acidophilus TN Rhodopseudomonas palustris RD
CFU/m l OD660nm pH CFU/m l OD660nm pH 8/20 2,8.108 2,25 4,92 2,03.108 1,25 5,05 10/20 7,4.108 2,58 4,03 2,7.108 2,02 4,7 12/20 8,7.109 2,89 3,95 3,2.109 2,2 3,8 16/20 6,3.109 2,89 3,86 5,1.109 2,23 3,77
Bảng 3.14: Xác định điều kiện cấp khí trong bình lên men Bacillus
Chỉ số
Chủng Oxi Khuấy pH OD CFU/ml
B.licheniformis G1 130% 500 7,26 1,22 5,5.109
B.subtilis DA 130% 500 6,67 1,27 8,5.109
B.megaterium PA 130% 500 7,22 1,18 6,07.109
Trong quá trình lên men, việc thu hồi sinh khối vào thời điểm thích hợp cũng có ý nghĩa về mặt kinh tế. Thời gian lên men thích hợp với Bacillus,
rằng thời gian thu hồi sinh khối đối với Bacillus và L.acidophilus TN thích hợp nhất là sau 24 giờ. Đối với R.palustris RD thời gian thích hợp là sau 5 ngày (bảng 3.15, 3.16)
Bảng 3.15: Khảo sát thời gian lên men Bacillus và L.acidophillus TN
Thời gian (giờ)
B.subtilis DA B.megaterium PA B.licheniformis G1 L.acidophilus LA
CFU/ml OD660 CFU/ml OD660 CFU/ml OD660
CFU/m l OD660 16 1,2.109 2,73 8,7.108 2,67 3,7.108 2,76 2,8.108 2,25 24 8,2.109 3,21 6.109 2,97 5,11.109 3,11 7,4.109 2,88 32 8,3.109 3,24 5.7.109 2,78 6,8.109 2,91 6,7.109 2,80 36 6,8.109 2,96 4,11.109 2,9 6,4.109 2,86 6,3.100 2,78
Bảng 3.16: Khảo sát thời gian lên men R.palustris RD
Thời gian (ngày) R.palustris RD CFU/ml OD660nm pH 3 2,13.108 1,25 5,05 4 2,27.108 2,02 4,7 5 3,2.109 2,2 3,8 6 5,4.109 2,23 3,78
Qua kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi nhận thấy: 3 chủng B.subtilis DA, L.acidophillus TN và R.palustris RD đáp ứng tối ƣu nhất các chỉ tiêu nghiên cứu.
Vì vậy chúng tôi sử dụng 3 chủng vi khuẩn B.subtilis DA, L.acidophillus TN và
R.palustris RD cho việc sản xuất chế phẩm bằng phƣơng pháp lên men chìm.
3.2.2. Kết quả nghiên men Bacillus, Lactobacillus trên môi trƣờng xốp
Lên men Lactobacillus trên môi trường xốp
Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men trên môi trƣờng xốp nhƣ: thành phần môi trƣờng, nhiệt độ, tỷ lệ giống, thời gian.
Tỷ lệ giống Lactobacillus thích hợp đƣợc khảo sát nhằm tối ƣu quá trình lên men trên môi trƣờng xốp. Trong quá trình lên men trên môi trƣờng xốp, tỷ lệ
giống thích hợp còn có tác dụng đảm bảo độ ẩm môi trƣờng lên men, giảm pH trong môi trƣờng và giảm sự lây nhiễm trong quá trình lên men. Tỷ lệ giống đƣợc khảo sát: 20, 30, 50, 65%. Kết quả cho thấy tỷ lệ giống 30% là thích hợp nhất (Bảng 3.17).
Bảng 3.17: Tỷ lệ giống thích hợp
Tỷ lệ giống (%) CFU/g chế phẩm lên men
20 6,8.108
30 9,7.108
50 3,1.108
65 8,5.107
Đối với vi khuẩn L.acidophillus, nguồn bột có tác dụng nhƣ chất phụ gia, chất mang và chất bảo quản vi khuẩn. Cơ chất không thể thiếu trong quá trình lên men L.acidophillus là nguồn cacbon, 5 loại đƣờng thƣờng đƣợc sử dụng để len men Lacto trên môi trƣờng xốp: sucrose, glucose, lactose, maltose, mannitol. Kết quả cho thấy L.acidophillus TN sử dụng tốt đƣờng sucrose, glucose, sử dụng maltose hiệu quả kém và hầu nhƣ không sử dụng đƣờng lactose và mannitol. Nhƣ vậy, glucose, sucrose là nguồn cacbon thích hợp để lên men Lactobacillus
trên môi trƣờng xốp với mật độ tế bào đạt đƣơc 109
CFU/g chế phẩm lên men (bảng 3.18).
Bảng 3.18: Nguồn cacbon thích hợp đối với lên men Lactobacillus trên môi trƣờng xốp
Nguồn cacbon CFU/g chế phẩm lên men
Sucrose 9,1.109
Glucose 4,2.109
Lactose 9,5.108
Maltose 1,3.108
Thời gian lên men đƣợc theo dõi sau 1, 2, 4, 6 và 8 ngày thấy rằng: sau 2 ngày lên men, số lƣợng tế bào đạt đƣợc: 5,8.109
CFU/g và ổn định trong vòng vài ngày, sau đó bắt đầu giảm (bảng 3.19)
Bảng 3.19: Thời gian lên men thích hợp
Thời gian (ngày) CFU/g chế phẩm
1 4,3.108
2 5,8.109
4 6,6.109
6 5,4.108
8 1,2.107
Lên men Bacillus trên môi trường xốp
Tƣơng tự nhƣ lên men chìm đối với vi khuẩn Bacillus, để nhận đƣợc chế phẩm lên men đảm bảo chất lƣợng, một số điều kiện lên men cơ bản cần đƣợc khảo sát: thành phần môi trƣờng lên men, nhiệt độ lên men, tỷ lệ giống bổ sung và thời gian lên men.
Thành phần lên men Bacillus trên môi trƣờng xốp đƣợc nghiên cứu bao gồm bột sắn, bột đậu tƣơng, bột gạo, bột cám và đƣờng tỷ lệ khác nhau. Qua nghiên cứu thấy rằng: có thể sử dụng môi trƣờng chứa đậu tƣơng, bột gạo, bột cám để len men, đạt chất lƣợng: 1,07.109
CFU/g chế phẩm lên men hoặc môi trƣờng chỉ có bột gạo, bột cám cũng đạt chất lƣợng tƣơng đƣơng: 1,2.109
CFU (bảng 3.20).
Nhƣ vậy, môi trƣờng có bột cám tạo độ xốp, lƣợng không khí nhiều hơn vì vậy lên men có hiệu quả hơn.
Bảng 3.20: Thành phần lên men Bacillus trên môi trƣờng xốp
STT Thành phần B.licheniformis G1 B.subtilis DA B.megaterium PA
1 Bột đậu, bột sắn 1,7.108 2,2.108 1,8.108 2 Bột đậu, bột gạo 2.108 6,8.108 1,2.108 3 Bột đậu, bột cám 2,07.108 3,7.108 3.108 4 Bột gạo, bột cám 1,11.109 1,2.109 1.108 5 Bột đậu, bột gạo, bột cám 6,1.10 8 2,3.109 1,1.109
Ảnh hƣởng của nguồn cacbon (đƣờng) đến quá trình lên men trên môi trƣờng xốp cũng đƣợc nghiên cứu trên 4 loại đƣờng thông dụng: sucrose, glucose, lactose và maltose đƣợc sử dụng để len men. Kết quả cho thấy các chủng Bacillus nghiên cứu hầu nhƣ không sử dụng hoặc sử dụng đƣờng sucrose, maltose kém, đối với đƣờng glucose, lactose kết quả không chênh lệch nhiều (Bảng 3.21)
Bảng 3.21: Ảnh hƣởng nguồn cacbon đến quá trình lên men Bacillus trên môi trƣờng xốp
STT Thành phần B.licheniformis G1 B.subtilis DA B.megaterium PA
1 Sucrose 1,2.108 2,1.108 1,1.108 2 Glucose 3.108 6,6.108 2.5.108 3 Lactose 2,34.108 4,3.108 3.108 4 Maltose 1,11.108 1,6.108 1.108
Lên men Bacillus trên môi trƣờng xốp đƣợc tiến hành ở nhiệt độ 28, 30, 34 và 370C. Kết quả nhận thấy nhiệt độ hầu nhƣ không ảnh hƣởng đến quá trình lên men trên môi trƣờng xốp. Có thể lên men trên môi trƣờng xốp ở nhiệt độ từ 28-370C (bảng 3.22).
Bảng 3.22: Nhiệt độ lên men Bacillus trên môi trƣờng xốp STT Nhiệt độ (0C) B.licheniformis G1 B.subtilis DA B.megaterium PA 1 28 3,2.108 9,48.108 4,1.108 2 30 4,5.108 1,8.109 2.5.108 3 34 3,34.108 1,56.109 3.108 4 37 2,11.108 1,46.109 1.108
Lên men Bacillus trên môi trƣờng xốp thực hiện với tỷ lệ giống: 20, 25, 30 và 35%. Có thể bổ sung giống với tỷ lệ 25-30% (Bảng 3.23)
Bảng 3.23: Tỷ lệ giống lên men Bacillus trên môi trường xốp
STT Tỷ lệ giống B.licheniformis G1 B.subtilis DA B.megaterium PA
1 20 3,1.108 4,3.108 1,8.108 2 25 4,2.108 5,8.109 1,5.109 3 30 2,5.108 6,6.109 9,5.108 4 35 1,3.106 5,4.107 7,5.107
Thời gian lên men thích hợp cũng đƣợc theo dõi. Đối với lên men chìm, sau 24 giờ có thể thu hồi sinh khối nhƣng trên môi trƣờng xốp, thời gian để vi khuẩn làm quen với môi trƣờng dài hơn, do vậy, lên men với thời gian lâu hơn. Thời gian lên men Bacillus trên môi trƣờng xốp đƣợc nghiên cứu sau 1, 2, 4, 6, 8 ngày. Sau 2 ngày theo dõi thấy màu của môi trƣờng thay đổi, vàng hơn và có mùi thơm. Trong thời gian 2-4 ngày đạt số lƣợng tế bào cao nhất và giảm sang ngày thứ 6 (Bảng 3.24)
Bảng 3.24: Thời gian lên men Bacillus trên môi trƣờng xốp thích hợp
STT Thời gian lên men (ngày) B.licheniformis G1 B.subtilis DA B.megaterium PA 1 1 6,3.107 9,2.107 3,2.107 2 2 7,2.107 2,2.108 1,2.108 3 4 2,5.108 1,5.109 1,5.108 4 6 1,2.108 1,2.109 1,3.108 5 8 1,7.107 1,8.108 1,1.107
Từ kết quả nghiên cứu lên men trên môi trƣờng xốp các chủng vi khuẩn. Chúng tôi đã lựa chọn sử dụng 2 chủng vi khuẩn B.subtilis DA, L.acidophillus TN cho việc sản xuất chế phẩm.
Nhƣ vậy, để len men vi sinh tạo chế phẩm sinh học sử lý môi trƣờng nƣớc nuôi trồng thủy sản,chúng tôi tiến hành cả hai phƣơng pháp lên men chìm và lên men trên môi trƣờng xốp.
Chế phẩm dạng dịch tiến hành lên men chìm, lựa chọn các chủng
L.acidophilus TN, B.subtilis DA và R.palustris RD.
Chế phẩm dạng bột đƣợc tạo ra bằng phƣơng pháp lên men trên môi trƣờng xốp 2 chủng đƣợc lựa chọn là L.acidophilus TN và B.subtilis DA
Chất lƣợng chế phẩm lên men đạt từ 108
-109 CFU trong 1 ml hoặc 1 g. Quy trình lên men tạo chế phẩm đƣợc tóm tắt trong sơ đồ hình 3.4:
-
Sơ đồ quy trình lên men chìm và lên men trên môi trƣờng xốp
Giống R. palustris RD
Nhân giống
Lên men chìm
Thu hồi sinh khối
Kiểm tra chất lƣợng
Lên men trên mt xốp
Giống B. subtilis DA Giống L.acidophillus TN
R. palustris RD Nuôi tĩnh, 6 ngày, 300C, chiếu sáng B.subtilis DA Sục khí, 48 giờ, 370C, khuấy 500v/p L.acidophillus TN Nuôi tĩnh, 24 ngày, 340C B.subtilis DA 25-30% giống 370C, 72 giờ L.acidophillus TN 25-30% giống 340C, 72 giờ
3.3. Kết quả nghiên cứu kỹ thuật thu hồi sinh khối tạo chế phẩm và bảo quản chế phẩm
3.3.1. Tạo chế phẩm dạng dịch và dạng bột
Chế phẩm sinh học xử lý nƣớc nuôi trồng thủy sản đƣợc sản xuất từ chủng Lactobacillus acidophilus TN, Rhodopseudomonas palustris RD và
Bacillus subtilis DA. Chế phẩm đƣợc tạo thành nhƣ sau:
Chế phẩm dạng dịch đƣợc tạo thành từ dịch lên men Bacillus subtilis DA
đƣợc thu hồi, sau đó trộn với dịch lên men Lactobacillus acidophilus TN và Rhodopseudomonas palustris RD theo tỷ lệ:
(L.acidophilus TN: R. palustris RD :B.subtilis DA – 4:2:4) và bổ sung chất bảo quản. Tạo chế phẩm dạng bột bằng cách: B.subtilis DA đƣợc lên men, sấy khô, nghiền thành bột và trộn với L.acidophilus TN cũng đƣợc thu hồi và bổ sung chất bảo quản với tỷ lệ thích hợp
Bacillus subtilis DA là vi khuẩn sinh bào tử nên khả năng chịu nhiệt cao, chịu ẩm khá tốt. Có thể làm khô chế phẩm lên men Bacillus subtilis DA bằng phƣơng pháp sấy nhiệt với nhiệt độ từ 50-700C. Ở nhiệt độ này, những vi sinh vật bị nhiễm trong quá trình lên men bị loại trừ. Vì vậy, chế phẩm thu đƣợc có độ tinh khiết cao. Tuy nhiên, chế phẩm dạng bột ngoài thành phần Bacillus subtilis DA còn có Lactobacillus acidophilus TN. Tuy rằng, nhiệt độ sấy của
Lactobacillus chỉ ở khoảng 400C, không đủ cao để diệt vi khuẩn nhiễm vào chế phẩm trong quá trình lên men nhƣng lợi thế của vi khuẩn Lactobacillus là sinh axit lactic và chất kháng khuẩn loại trừ sự lây nhiễm của vi sinh vật.
Đối với chế phẩm dạng dịch, sự có mặt của vi khuẩn Lactobacillus cũng đƣợc xem là yếu tố của sự thành công bởi không những có tác dụng ngăn ngừa sự lây nhiễm trong thời gian bảo quản chế phẩm mà còn có tác dụng diệt vi khuẩn lây nhiễm trƣớc và khi tạo chế phẩm.
Để sấy chế phẩm lên men Bacillus, tiến hành sấy ở các nhiệt độ: 50, 60, 65, 700C. Kết quả nhận thấy Bacillus subtilis DA có thể sấy từ 50-700C (Bảng 3.25)
Bảng 3.25: Nhiệt độ sấy thích hợp đối với chế phẩm lên men B.subtilis DA
Nhiệt độ (0C)
Thời gian sấy (giờ) Chế phẩm lên men (CFU/g) Chế phẩm khô (CFU/g) 50 6 5,5.109 3,5.109 60 5 5,5.109 3,7.109 65 4 5,5.109 3,05.109 70 3,5 5,5.109 1,9.109
Thành phần công thức bảo quản chế phẩm bột đƣợc trình bày trong bảng 3.26.
Bảng 3.26: Thành phần công thức tạo chế phẩm bột
STT Thành phần Chế phẩm(CFU/g)
1 B.subtilis DA + L.acidophillus TN 3.109 2 B.subtilis DA + L.acidophillus TN + bột 3,5.108 3 B.subtilis DA + L.acidophillus TN + sucrose 5,2.108 4 B.subtilis DA + L.acidophillus TN + lactose 4,1.108 5 B.subtilis DA + L.acidophillus TN + Na2CO3 3,9.108
Tƣơng tự, chế phẩm dạng dịch cũng đƣợc tạo thành bằng một số công thức có bổ sung chất bảo quản. Tuy nhiên, cũng giống nhƣ chế phẩm dạng bột, vai trò của các chất bảo quản không mấy tác dụng. Từ đó có thể thấy chính L.acidophillusTN
đóng vai trò tích cực nhƣ một thành phần bảo quản của chế phẩm (Bảng 3.27).
Bảng 3.27: Thành phần công thức tạo chế phẩm dạng dịch
STT Thành phần Chế phẩm(CFU/g)
1 B.subtilis DA + L.acidophillus TN+ R.palustris RD 7,8.109 2 B.subtilis DA + L.acidophillus TN+ R.palustris RD +
sucrose 5,5.10
8
3 B.subtilis DA + L.acidophillus TN+ R.palustris RD
+ lactose 5.10
8
4 B.subtilis DA + L.acidophillus TN+ R.palustris RD
+ lactose + Na2S2O3 4,6.10
3.3.2. Thử an toàn với động vật thí nghiệm
Mẫu thử nghiệm chế phẩm dạng lỏng và chế phẩm dạng bột gồm 5 chủng đang sử dụng: B.licheniformis G1, B.subtilis DA, B.megaterium PA , L.acidophillus TN, R.palustris RD đƣợc thử độc tính trên đối tƣợng chuột nhắt trắng. Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên 50 con chuột nhắt trắng chia làm 5 nhóm với liều thử khác nhau. Theo dõi sau 5 ngày thấy chuột vẫn bình thƣờng, không có biểu hiện khác nhóm chuột đối chứng (Bảng 3.28, 3.29).
Bảng 3.28: Kết quả thử độc tính cấp của chế phẩm bột Nhóm Thế tích cho uống (ml/10g chuột) Liều dùng (g/kg chuột) Số lƣợng chuột Số lƣợng chuột chết 1 0,5ml nƣớc cất (ĐC) - 10 0 2 0,2 ml mẫu thử 5 10 0 3 0,4 ml mẫu thử 10 10 0 4 0,4 ml mẫu thử x 2 lần 20 10 0 5 0,4 ml mẫu thử x 3 lần 30 10 0 Bảng 3.29: Kết quả thử độc tính cấp của chế phẩm lỏng Nhóm Thế tích cho uống (ml/10g chuột) Liều dùng (ml/kg chuột) Số lƣợng chuột Số lƣợng chuột chết 1 0,5ml nƣớc cất (ĐC) - 10 0 2 0,2 ml mẫu thử 20 10 0 3 0,4 ml mẫu thử 40 10 0 4 0,4 ml mẫu thử x 2 lần 80 10 0 5 0,4 ml mẫu thử x 3 lần 120 10 0
3.3.3. Kỹ thuật bảo quản chế phẩm
Chế phẩm dạng bột đƣợc đóng vào túi thiếc hàn kín; chế phẩm dạng dịch đóng lọ, siu nắp kín. Theo dõi độ ổn định của chế phẩm theo thời gian với phƣơng pháp bảo quản nhƣ đã trình bày thấy rằng chế phẩm dạng dịch và dạng bột bảo quản đƣợc 12 tháng, chất lƣợng đạt 108
CFU/ml hoặc gam chế phẩm. Kết quả nghiên cứu bảo quản chế phẩm dạng dịch, dạng bột đƣợc trình bày ở bảng 3.30 và 3.31.
Bảng 3.30: Bảo quản chế phẩm dạng dịch
Thành phần công thức CFU/ml sau thời gian bảo quản (Tháng)
1 3 6 8 10 12 B.subtilis DA + L.acidophillus TN+ R.palustris RD 7,2.108 7,9.108 5,8.108 3.108 2.108 1,2.108 B.subtilis DA + L.acidophillus TN+ R.palustris RD + sucrose 5.108 2.108 2,1.108 3,1.106 5,8.104 1,1.103 B.subtilis DA +