3. Nội dung nghiên cứu
2.4.4.Phƣơng pháp định tính vi khuẩn nghiên cứu
Định tính vi khuẩn Bacillus, L.acidophillus TN, R.palustris RD dựa trên nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, bào tử, đặc điểm sinh hóa [12, 18, 19, 21].
- Xác định đặc điểm khuẩn lạc: Quan sát đặc điểm khuẩn lạc của Bacillus
trên môi trƣờng MPA; L.acidophillus TN trên môi trƣờng MRS và của
R.palustris RD trên môi trƣờng SA bổ sung agar. Cấy các vi khuẩn trên môi trƣờng thích hợp, nuôi 24-48h. Chọn những đĩa thạch có khuẩn mọc riêng rẽ để quan sát.
- Xác định hình thái tế bào, bào tử: Có thể sử dụng môi trƣờng lỏng hay môi trƣởng thạch để quan sát đặc điểm hình thái tế bào, bào tử. Vi khuẩn sau khi đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng thích hợp, làm tiêu bản, nhuộm Gram. Quan sát
hình dạng tế bào, cách sắp xếp, bào tử trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần.
- Khả năng sinh enzyme catalase: Sử dụng môi trƣờng MRS đối với
L.acidophillus TN và môi trƣờng MPA với Bacillus. Vi khuẩn sau khi nuôi cấy, hòa thành hỗn dịch với 1 giọt nƣớc oxy già (3-5% H2O2). Vi khuẩn sinh catalase tạo thành bọt khí.
- Khả năng lên men đƣờng sinh axit: sử dụng môi trƣờng thạch bán lỏng MRS đối với L.acidophillus TN và môi trƣờng MPA với Bacillus, bổ sung đƣờng sucrose, mannose, bổ sung chất chỉ thị màu ( xanh metylen), cho vào ống nghiệm, khử trùng. Cấy vi khuẩn cần xác định lên môi trƣờng, nuôi 5 ngày. Quan sát sự phát triển và sự chuyển màu của môi trƣờng.
- Lên men làm đông sữa, sinh axit: Môi trƣờng để xác định gồm sữa ông thọ 30%. Sữa đƣợc thanh trùng, để nguội. Cấy vi khuẩn cần xác định. Nuôi 24- 48h. Quan sát mức độ đông, mùi, vị sữa lên men.
- Khả năng sử dụng sulfua của chủng R.palustris RD: nuôi cấy chủng trong môi trƣờng có chứa Na2S với hàm lƣợng 2mM ( tƣơng đƣơng 64mgD/L). Thí nghiệm tiến hành trong điều kiện kị khí, chiếu sáng. Xác định hàm lƣợng sulfua còn lại trong môi trƣờng sau 5 ngày nuôi cấy.
Phương pháp xác định độ tinh khiết của chế phẩm:
- Độ tinh khiết của chế phẩm đƣợc xác định trên môi trƣờng MRS đối với
L.acidophillus TN; môi trƣờng MPA với Bacillus và môi trƣờng SA với
R.palustris RD. Chế phẩm chỉ bao gồm những vi khuẩn nghiên cứu.
Phương pháp định lượng
- Xác định số lƣợng tế bào vi khuẩn trong 1g ( 1ml) chế phẩm trên môi trƣờng MRS đối với L.acidophillus TN; MPA với Bacillus và T với R.palustris RD. Cân 1g hoặc hút 1ml chế phẩm vào bình nón chứa NaCl 0,9%. Hòa loãng chế phẩm để đạt đƣợc những nồng độ pha loãng 10-4
, 10-5. Nuôi và đếm số khuẩn lạc ở các đĩa petri có số khuẩn lạc <100. Tính số CFU/ml(g) theo công thức:
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu tuyển chọn giống sản xuất
3.1.1. Chọn chủng có hoạt tính sinh học ổn định, an toàn với vật nuôi
Việc thƣờng xuyên chọn chủng vi sinh vật mang những đặc tính cần thiết, sử dụng để sản xuất chế phẩm xử lý môi trƣờng nuôi trồng thủy sản đƣợc cho là khâu quan trọng trong quy trình sản xuất chế phẩm. Tiêu chí đặt ra để tuyển chọn chủng là sinh enzym phân hủy hữu cơ, đối kháng với Vibrio, chịu mặn và đảm bảo an toàn cho vật nuôi.
Đối kháng với vi khuẩn gây bệnh tôm, cá
Vibrio và vi khuẩn gây bệnh cơ hội, trong điều kiện môi trƣờng bị ô nhiễm, Vibrio gây ra một số bệnh cho tôm nhƣ bệnh phát sáng, bệnh mòn đuôi, cụt râu, bệnh phân trắng... kiểm tra khả năng đối kháng với Vibrio fuosini (V.f)
và Vibrio parahaemolyticus (V.p) của 4 chủng đang sử dụng, thấy rằng
L.acidophillus TN ức chế mạnh sự phát triển của vi khuẩn V.fuosini và
V.parahaemolyticus (bảng 3.1). Ngoài ra, B.lichenniformis G1 cũng ức chế sự phát triển của vi khuẩn V.f và V.p, nhƣng yếu hơn L.acidophillus TN
Bảng 3.1. Kiểm tra khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh tôm cá
Chủng vi sinh vật Khả năng đối kháng
Vibrio fuosini Vibrio parahaemolyticus
L.acidophillus TN +++ +++
B.licheniformis G1 + +
B.subtilis DA - -
B.megaterium PA + -
Hoạt tính phân hủy hữu cơ
Khả năng phân hủy hữu cơ, làm sạch môi trƣờng nhờ sinh enzym phân hủy hữu cơ nhƣ protease phân hủy protein, amylase phân hủy tinh bột, cellulase phân hủy cellulose, chủ yếu xuất hiện ở nhóm vi khuẩn hoại sinh có bào tử thuộc chi Bacillus. Khả năng sinh enzym phân hủy hữu cơ là một trong những tiêu chí quan trọng để tuyển chọn chủng phục vụ cho việc sản xuất chế phẩm xử lý môi trƣờng nuôi trồng thủy sản. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.2
Bảng 3.2. Khả năng sinh enzym phân hủy hữu cơ của vi khuẩn
Chủng vi sinh vật Protease Amylase Cellulose
L.acidophillus TN - - -
B.licheniformis G1 ++ ++ ++
B.subtilis DA ++ ++ ++
B.megaterium PA ++ - -
Chú thích: -: không sinh enzym, ++: có sinh enzym
Ba chủng Bacillus trong thử nghiệm đều có khả năng sinh enzyme phân hủy hữu cơ. Tuy nhiên, chỉ có B.licheniformis G1 và B.subtilis DA có khả năng sản sinh ra enzyme phân hủy đƣợc cả 3 loại chất hữu cơ là Protease, Amylase và Cellulose.
Khả năng chịu mặn
Hầu hết diện tích nuôi tôm sú đều nằm trong vùng nƣớc lợ hoặc nƣớc mặn. Bởi vậy, việc chọn những chủng vi khuẩn có khả năng chịu mặn cao để tồn tại và sinh trƣởng trong môi trƣờng có độ muối cao đƣợc nghiên cứu. Khả năng chịu mặn của 5 chủng vi khuẩn sử dụng đều có khả năng chịu đƣợc 5% NaCl, trong khi độ mặn của môi trƣờng nuôi chỉ dƣới 3%. Riêng 3 chủng
B.megaterium PA và B.subtilis DA chịu đƣợc 10% NaCl ( hình 3.1).
Hình 3.1: Khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn
TN: L.acidophillus TN; G1: B.licheniformis G1; DA: B.subtilis; PA: B.megaterium PA; RD: R.palustris RD
NaCl OD
Khả năng sinh trưởng trong các nguồn nước thải
Theo dõi mức độ tích lũy sinh khối của chủng vi khuẩn tía
Rhodopseudomonas palustris trong các nguồn nƣớc thải sau một tuần cho thấy:
Rhodopseudomonas palustris có khả năng sinh trƣởng trong các môi trƣờng nƣớc thải thử nghiệm, với các mức độ tích lũy sinh khối khác nhau. Sự tích lũy sinh khối của Rhodopseudomonas palustris đƣợc trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3: Khả năng sinh trƣởng (theo tích lũy sinh khối OD660) của chủng vi khuẩn tía Rhodopseudomonas palustris trong các nguồn nƣớc thải
Nƣớc thải Chủng Nƣớc thải sản xuất bún Nƣớc thải chăn nuôi Nƣớc kênh ô nhiễm Rh. palustris RD 1.26 3.02 1.18
Kết quả thu đƣợc cho thấy chủng vi khuẩn tía Rhodopseudomonas palustris có khả năng sinh trƣởng tốt trong môi trƣởng nƣớc thải chăn nuôi và vẫn sinh trƣởng bình thƣờng trong môi trƣờng nƣớc thải ô nhiễm có nguồn hữu cơ thấp. Nhƣ vậy, việc tích lũy sinh khối của vi khuẩn Rhodopseudomonas palustris từ nguồn hữu cơ trong nƣớc thải là một trong những yếu tố đóng vai trò làm sạch nguồn nƣớc thải chăn nuôi.
Từ kết các kết quả nghiên cứu cho thấy các chủng vi khuẩn lựa chọn có đầy đủ những đặc tính sinh học phù hợp, đáp ứng các chỉ tiêu của chủng giống dùng để sản xuất chế phẩm sinh học.
Cả 03 chủng vi khuẩn Bacillus đều có hoạt lực enzyme phân hủy hữu cơ: amylase, protease, cellulase đáng kể. Vì thế chúng có khả năng phân hủy nhanh các hợp chất hữu cơ phân tử lớn thành các hợp chất có phân tử lƣợng nhỏ. Đặc tính này rất có ý nghĩa trong việc sử dụng vào mục đích tạo chế phẩm xử lý môi trƣờng nuôi trồng thủy sản.
Chủng vi khuẩn L.acidophilus TN có khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh tôm cá, có tác dụng ngăn chặn một số bệnh dịch do vi khuẩn gây ra.
Chủng vi khuẩn tía R.palustris RD có khả năng sử dụng nguồn hữu cơ trong môi trƣờng nƣớc thải ô nhiễm để tích lũy sinh khối, đây là một trong những tác dụng quan trọng trong việc xử lý nguồn nƣớc nuôi trồng thủy sản bị ô nhiễm .
Các chủng đang nghiên cứu đều có khả năng chịu mặn cao.
3.1.2. Xác định điều kiện nhân giống
Điều kiện nhân giống Bacillus
Một trong những mục tiêu đặt ra là sản xuất giống đảm bảo chất lƣợng. Trong đó, thành phần môi trƣờng nhân giống là yếu tố quan trọng nhất, ảnh hƣởng đến chất lƣợng giống trong quá trình sản xuất. Bằng việc bổ sung thêm một số thành phần với liều lƣợng thích hợp vào môi trƣờng nuôi cấy thông qua các chủng vi khuẩn Bacillus (môi trƣờng MPA3), đã nhận đƣợc môi trƣờng thích hợp, tăng mật độ tế bào trong 1ml giống từ 108
đến 109 (Bảng 3.4).
Bảng 3.4: Thành phần môi trƣờng nhân giống Bacillus thích hợp Ký hiệu
MT Thành phần CFU/ml
G1 DA PA
MPA 1 Pepton, cao thịt, NaCl 2,6.108 2,12.108 1,15.108 MPA 2 Pepton, cao thịt, cao men, NaCl 3.108 2,4.108 2,7.108 MPA 3 Pepton, cao men, NaCl, MgSO4,
(NH4)2SO4
2,1.109 6,1.109 1,01.109
Nhiệt độ cũng là một trong những yếu tố cần quan tâm trong quá trình nhân giống, Bacillus đƣợc nhân giống ở nhiệt độ 280C, 300C, 340C, 370C, thấy rằng có thể nhân giống Bacillus ở nhiệt độ nhân giống từ 280C-370C (Bảng 3.5), rất thuận lợi cho việc triển khai nhân giống tại cơ sở sản xuất.
Bảng 3.5: Nhiệt độ nhân giống Bacillus thích hợp
Nhiệt độ (0C)
B.licheniformis G1 B.subtilis DA B.megaterium PA
CFU/ml OD660 pH CFU/ml OD660 pH CFU/ml OD660nm pH
28 7,2.108 2,73 7,7 8,7.108 2,67 8,7 3,7.108 2,76 8,7
30 8,7.108 2,90 8,0 2.109 2,77 8,8 1,11.109 3,11 8,8
34 3.02.109 3,01 8,5 4.07.109 2,98 9,7 8,8.108 2,91 9,5
37 2,02.109 2,96 8,2 4,11.109 2,9 8,8 7,4.108 2,06 8,1
Tỷ lệ giống thích hợp để nhân giống cũng đƣợc khảo sát và thấy rằng có thể sử dụng giống Bacillus theo tỷ lệ 5-10% (Bảng 3.6).
Bảng 3.6: Tỷ lệ giống thích hợp Tỷ lệ giống (%) CFU/ml G1 DA PA 5 6,6.108 9,12.108 1,15.108 7,5 1,08.109 4,4.109 2,7.109 10 2,1.109 6,6.109 3,1.109
Môi trƣờng và điều kiện tối ƣu để nhân giống Bacillus là môi trƣờng MPA 3 (Pepton, cao men, NaCl, MgSO4, (NH4)2SO4); Nhiệt độ thích hợp để nhân giống là 340
C-370C; tỷ lệ giống từ 7,5%
Điều kiện nhân giống Lactobacillus acidophillus TN
Tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến chất lƣợng giống
L.acidophillus TN nhƣ thành phần môi trƣờng, nhiệt độ, pH, môi trƣờng nhân giống, tỷ lệ giống đƣợc nghiên cứu. Kết quả đƣợc trình bày ở Bảng 3.7, 3.8 3.9, 3.10.
Bảng 3.7: Thành phần môi trƣờng nhân giống L.acidophillus TN thích hợp
MT Thành phần Đánh giá sự phát triển
CFU/ml OD660nm pH
MRS Cao thịt,pepton, glucose, cao men, khoáng 4,5.108 3,69 3,22 NB Cao thịt, pepton, muối khoáng 5,1.106 0,98 5,81 CC Pepton, glucose, nƣớc chiết cà chua 5,6.107 1,92 4,7 BC Pepton, glucose, nƣớc chiết bắp cải 3,4.107 1,77 4,5
Bảng 3.8: Nhiệt độ nhân giống Lactobacillus acidophillus TN thích hợp
Nhiệt độ (0 C) Đánh giá sự phát triển CFU/ml OD660nm pH 28 3,7.108 2,85 4,05 30 1,05.109 3,0 3,81 34 2,1.109 3,1 6,69 37 7,0.108 2,2 8,8
Bảng 3.9: pH môi trƣờng nhân giống L.acidophillus TN thích hợp
pH MT đầu Đánh giá sự phát triển CFU/ml OD660nm pH 5,5 1,4.108 2,61 4,37 6 4,2.109 3,1 3,4 6,5 1,8.109 2,8 3,6
Bảng 3.10: Tỷ lệ giống L.acidophillus TN thích hợp
Tỷ lệ giống (%) Đánh giá sự phát triển
CFU/ml OD660nm pH
5 2,2.108 3,19 3,95
7,5 2,8.109 3,22 3,92
10 3,7.109 3,25 3,91
Từ kết quả nghiên cứu trên chúng tôi nhận thấy môi trƣờng và điều kiện thích hợp để nhân giống L.acidophillus TN là môi trƣờng MRS (cao thịt, pepton, glucose, cao men, muối khoáng); nhân giống ở nhiệt độ 340C; pH môi trƣờng trƣớc khi nhân giống bằng 6; có thể sử dụng tỷ lệ giống từ 5-10%
Quy trình nhân giống Rhodopseudomonas palustris RD
Nhu cầu vitamin, pH môi trƣờng và nhiệt độ nuôi cấy là những yếu tố chủ yếu ảnh hƣởng trực tiếp đến sự tăng trƣởng của chủng vi khuẩn tía không lƣu huỳnh R.palustris RD. Sử dụng kết quả các thí nghiệm để tìm ra điều kiện nuôi cấy tối ƣu cho việc nhân giống R.palustris RD (bảng 3.11, 3.12).
Để xác định nhu cầu vitamin của chủng R.palustris RD tiến hành nuôi trong môi trƣờng khuyết thiếu một trong sáu loại vitamin, kí hiệu: khuyết thiamin (-t), khuyết niacin (-n), khuyết p-aminobenzoic acid (-p), khuyết pyridoxal – HCl (-HCl), khuyết biotin (-b), khuyết vitamin B12 (-B12)
Bảng 3.11: Nhu cầu vitamin của Rhodopseudomonas palustris RD
vitamin
Chủng -b -p -t -n -HCl -B12
R.palustris RD - - + + + +
Chú thích: -: không sinh trưởng; +: có sinh trưởng
Bảng 3.12: Khả năng sinh trƣởng của R.palustris RD trong các khoảng pH pH
Chủng 5,5 6,0 7,0 8,0 8,5 9,0
Rh.palustris RD - ++ +++ +++ ++ -
Chú thích: -: không sinh trưởng, +: sinh trưởng yếu, ++: sinh trưởng trung bình, +++: sinh trưởng mạnh
Khi nhân giống R.palustris RD ngoài tự nhiên, nhiệt độ là một trong những điều kiện quan trọng ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển. Mức độ ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự tích lũy sinh khối đƣợc thể hiện trong đồ thị:
Hình 3.2: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sinh trƣởng của R.palustris RD Kết quả thử nghiệm cho thấy R.palustris RD có nhu cầu vitamin cần biotin, p-aminobenzoic acid. Không đòi hỏi có thiamin, pyridoxal –HCl, B12 và niacin. Khoảng pH sinh trƣởng tốt từ 6-8,5. Nhiệt độ nuôi cấy trong khoảng 250C-300C.
Từ các kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi tóm tắt trong sơ đồ quy trình nhân giống (hình 3.3).
0 C
Hình 3.3: Sơ đồ quy trình nhân giống
3.2. Kết quả nghiên cứu quy trình lên men sản xuất chế phẩm 3.2.1. Lên men chìm 3.2.1. Lên men chìm
Trong vài năm gần đây, ở các tỉnh phía Bắc do điều kiện thời tiết không đƣợc thuận lợi, mƣa bão thất thƣờng xảy ra nên những ngƣời nuôi tôm sú phải chịu nhiều rủi ro, thiệt hại về kinh tế. Mặc dù nghê nuôi tôm sú mang lại lợi nhuận cao hơn nhiều so với nuôi tôm nƣớc ngọt (tôm càng xanh) hay nuôi cá. Song một số ngƣời đã chuyển dần sang nuôi tôm nƣớc ngọt để giảm bớt rủi ro. Trƣớc thực trạng đó, việc đƣa ra loại chế phẩm giá thành hạ, phù hợp cho cả đối tƣợng nuôi nƣớc ngọt và nƣớc lợ là cần thiết.
Việc áp dụng hệ thống lên men sục khí trong sản xuất chế phẩm sinh học là một bƣớc tiến quan trọng nhằm gia tăng chất lƣợng của chế phẩm trong quá trình sử dụng. Tuy vậy, để sử dụng hệ thông lên men hiệu quả cần phải đặc biệt chú ý đến những yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men.
Kiểm tra tinh khiết
300C/ 48h. tĩnh
Hoạt hóa
Nhân giống cấp 1
Kiểm tra tinh khiết Kiểm tra tinh khiết
Nhân giống cấp 2 340C/ 24h. tĩnh 370C/ 24h. lắc 200v/p Giống cấp 3 370C/ 24h. lắc 200v/p 300C/ 48h. tĩnh, chiếu sáng 340C/ 24h. tĩnh
Đối với vi khuẩn Bacillus, độ thông khí có ý nghĩa quan trọng đối với quá trình lên men tạo sinh khối. Nhƣng ngƣợc lại, đối với L.acidophillus TN và
R.palustris RD chúng phát triển tốt trong điều kiện kém độ thông khí. Mặt khác, đối với việc sản xuất, bên cạnh mối quan tâm về sự phát triển của vi khuẩn, chất lƣợng và số lƣợng của từng mẻ lên men cũng rất quan trọng. Tiến hành khảo sát để làm sáng tỏ hai mục đích trên. Kết quả cho thấy: trong điều kiện lên men, có khuấy đối với L.acidophillus TN và không khuấy với R.palustris RD độ thông khí đƣợc quan sát bằng thể tích môi trƣờng/ thể tích bình (Vmt/Vb) lần lƣợt là: 12 lít/ 20 lít và 16 lít/ 20 lít là tối ƣu nhất. Nhƣng đối với Bacillus trong điều kiện lên men sục khí lƣợng Oxi cung cấp vào tối ƣu là 130%, lƣợng môi trƣờng nhân giống bình nhỏ là 10 lít/ 12 lít và 80 lít/ 120 lít.
Bảng 3.13: Xác định độ thông khí trong bình lên men L.acidophillus TN và
R.palustris RD
Độ thông khí Vmt/Vb (lít)
Lactobacilus acidophilus TN Rhodopseudomonas palustris RD
CFU/m l OD660nm pH CFU/m l OD660nm pH 8/20 2,8.108 2,25 4,92 2,03.108 1,25 5,05 10/20 7,4.108 2,58 4,03 2,7.108 2,02 4,7 12/20 8,7.109 2,89 3,95 3,2.109 2,2 3,8 16/20 6,3.109 2,89 3,86 5,1.109 2,23 3,77
Bảng 3.14: Xác định điều kiện cấp khí trong bình lên men Bacillus
Chỉ số
Chủng Oxi Khuấy pH OD CFU/ml
B.licheniformis G1 130% 500 7,26 1,22 5,5.109
B.subtilis DA 130% 500 6,67 1,27 8,5.109
B.megaterium PA 130% 500 7,22 1,18 6,07.109
Trong quá trình lên men, việc thu hồi sinh khối vào thời điểm thích hợp cũng có ý nghĩa về mặt kinh tế. Thời gian lên men thích hợp với Bacillus,