3. Nội dung nghiên cứu
3.5.Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm
Quy trình sản xuất chế phẩm bao gồm pha chế môi trƣờng nhân giống, nuôi cấy B.subtilis DA, L.acidophillus LA, R.palustris RD trên môi trƣờng tƣơng ứng. Lên men sục khí B.subtilis, lên men chìm, nuôi cấy tĩnh
L.acidophillus LA và R.palustris RD vào các bình nagel 20l.
Lên men B.subtilis DA, L.acidophillus LA trên môi trƣờng xốp thực hiện trong các túi PE.
Tạo chế phẩm, kiểm tra chất lƣợng, đóng túi thiếc hoặc chiết chai. Quy trình đƣợc tóm tắt nhƣ hình 3.6.
Hình 3.6: Quy trình sản xuất chế phẩm
Giống R. palustris RD Giống B. subtilis DA Giống L.acidophillus TN
Hoạt hóa
Nhân giống cấp 1; 2; 3
300C/ 48h. tĩnh, chiếu sáng
Lên men chìm
Thu hồi sinh khối
Kiểm tra chất lƣợng
Làm khô
Lên men trên mt xốp
Nghiền
Kiểm tra chất lƣợng
Trộn
Chất bảo quản
Kiểm tra pH Kiểm tra độ ẩm Trộn
Chất bảo quản
Nhân giống:
Chủng B.subtilis DA từ ống giống giữ trong glycerol đƣợc hoạt hóa trên môi trƣờng thạch MPA 3, kiểm tra độ tinh khiết, hoạt tính sinh học. Nhân giống cấp I vào bình trung tính 250ml chứa 150ml môi trƣờng MPA 3 lỏng, nuôi lắc 200 v/p, 370C, 24 giờ. Nhân giống cấp II vào bình trung tính 500ml chứa 250ml môi trƣờng MPA 3 lỏng, bổ sung giống tỷ lệ 10%, lắc 200 v/p, 370
C, 16-24 giờ. Giống cấp III đƣợc nhân trong bình nhỏ trong hệ thống lên men sục khí. Bình dung tích 15 lít chứa 10 lít môi trƣờng MPA 3 lỏng, sục khí nhẹ, khấy 500 v/p. Không khí đƣợc cấp từ máy nén khí tự động, qua cột lọc vô trùng vào bình nhân giống. Lên men sục khí 8-10 giờ, 370
C.
Chủng L.acidophillus TN từ ống giống đông khô, hoạt hóa trên môi trƣờng thạch MRS, nuôi cấy 340C trong 48 giờ. Kiểm tra độ tinh khiết, hoạt tính sinh học. Nhân giống cấp I vào bình trung tính 250ml chứa 200ml môi trƣờng MRS lỏng, nuôi tĩnh 340C, 24 giờ. Giống cấp II đƣợc nhân từ giống cấp I tỷ lệ 10% vào bình trung tính 500ml có 300ml môi trƣờng MRS lỏng, nuôi tĩnh 340
C, 24 giờ. Giống cấp III đƣợc nhân từ giống cấp II tỷ lệ 10% vào bình trung tính 1 lít chứa 600ml môi trƣờng MRS lỏng, nuôi tĩnh 340C, 24 giờ.
Chủng R.palustris RD từ ống giống hoạt hóa trên ống nghiệm chứa môi trƣờng SA lỏng, nuôi cấy tĩnh, chiếu sáng 48 giờ, 300C. Kiểm tra độ tinh khiết, hoạt tính sinh học. Nhân giống cấp I vào bình trung tính 250ml chứa 200 ml môi trƣờng SA lỏng, chiếu sáng, nuôi cấy 300C, 48 giờ. Giống cấp II đƣợc nhân từ giống cấp I tỷ lệ 10% vào bình trung tính 500ml có 300ml môi trƣờng SA lỏng, nuôi tĩnh, chiếu sáng, 300C, 48 giờ. Giống cấp III đƣợc nhân từ giống cấp II tỷ lệ 10% vào bình trung tính 1 lít chứa 600ml môi trƣờng SA lỏng, chiếu sáng, nuôi cấy 300C, 48 giờ.
Lên men chìm B.subtilis DA, L.acidophillus TN, R.palustris RD
Lên men chìm đƣợc tiến hành trên hệ thống lên men sục khí tự động của hãng Sartorius – Đức (hình 3.5)
Hình 3.7: Hệ thống lên men sục khí hãng Sartorius – Đức
Giống B.subtilis DA đƣợc nhân theo 3 cấp để đạt đƣợc lƣợng giống cần cho từng mẻ lên men (50 lít/ mẻ). Giống đƣợc chuyển từ bình lên men nhỏ sang bình lên men lớn qua đƣờng dẫn tiệt trùng khép kín. Lên men sục khí tiến hành trong bình lên men lớn, sục khí 130%, khuấy 500 v/p, 370C, 24 giờ.
Lên men chìm L.acidophillus TN thực hiện trong các bình nagel tiệt trùng có dung tích 20 lít chứa 16 lít môi trƣờng MRS. Hỗn dịch vi khuẩn sau khi nhân giống cấp III đƣợc chuyển sang bình lên men tỷ lệ 10%. Lên men 24 giờ ở 340
C trong điều kiện tĩnh.
Canh trùng R.palustris RD sau khi nhân giống cấp III đƣợc chuyển sang bình trung tính dung tích 20 lít có chứa 16 lít môi trƣờng SA lỏng, nuôi cấy tĩnh 300C, chiếu sáng liên tục trong 6 ngày.
Lên men chìm B.subtilis DA và L.acidophillus TN
Lên men B.subtilis DA trên môi trƣờng xốp đƣợc thực hiện trong các túi PE kích thƣớc 40×60 cm. Giống B.subtilis DA đƣợc trộn đều với bột gạo, bột
cám đã đƣợc loại bỏ trấu, bổ sung giống với tỷ lệ 30% để đảm bảo độ ẩm thích hợp cho quá trình lên men. Đóng hỗn hợp lên men vào túi PE độ thông khí 1/3 ( thể tích môi trƣờng/ thể tích túi), lên men 48 giờ.
Lên men L.acidophillus TN trên môi trƣờng xốp đƣợc thực hiện trong túi PE, 48 giờ. Trộn đều bột đậu tƣơng, bột gạo, bổ sung đƣờng glucoza hoặc sucrose, bổ sung giống tỷ lệ 30%, trộn đều. Đóng vào túi PE với độ thông khí 1/2 ( thể tích môi trƣờng/ thể tích túi).
Sản xuất chế phẩm
Chế phẩm lên men B.subtilis DA đƣợc làm khô. Đồng thời chế phẩm lên men L.acidophillus TN cũng đƣợc làm khô. Sau đó nghiền thành bột và trộn với nhau sao cho tổng số tế bào vi khuẩn trong 1 gam chế phẩm đạt 108
các loài B.subtilis DA và L.acidophillus TN. Đóng túi tráng kẽm 1kg/1 túi.
Chế phẩm dạng dịch đƣợc sản xuất từ dịch lên men L.acidophillus TN đã đƣợc bổ sung chất bảo quản, sau đó trộn với dịch lên men B.subtilis DA và R.palustris RD tỷ lệ (L.acidophilus TN: R.palustris RD : B.subtilis DA – 4:2:4) chiết ra chai 1 lít/1 chai.
Kiểm tra chất lượng chế phẩm
Kiểm tra độ tinh khiết chế phẩm trên môi trƣờng thạch tƣơng ứng của các chủng B.subtilis DA, L.acidophillus TN, R.palustris RD.
Cân 1g chế phẩm, pha loãng với nƣớc muối sinh lý sao cho khi trải trên mặt đĩa thạch , vi khuẩn mọc riêng rẽ. Quan sát hình thái khuẩn lạc, nhuộm tế bào quan sát dƣới kính hiển vi.
Chế phẩm chỉ bao gồm B.subtilis DA, L.acidophillus TN, R.palustris RD
mà không có bất kì loại nào khác.
Kiểm tra số lƣợng tế bào trong 1g hoặc 1 ml chế phẩm
Cân 1g hoặc hút 1ml chế phẩm, pha loãng theo bậc đến 10-8
với nƣớc muối sinh lý. Nhỏ 0,1 ml dung dịch chế phẩm đã pha loãng ở từng nồng độ pha loãng sang đĩa thạch môi trƣờng tƣơng ứng của từng chủng vi khuẩn. Nuôi cấy 48 giờ đối với L.acidophillus TN và R.palustris RD, 24 giờ B.subtilis DA. Đếm số khuẩn lạc có trong mỗi đĩa petri.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
1.Tuyển chọn đƣợc 3 chủng vi khuẩn có các đặc tính và tính chất phù hợp để sử dụng sản xuất chế phẩm sinh học: Chủng B.subtilis DA có hoạt lực enzyme phân hủy hữu cơ mạnh; Chủng L.acidophillus TN có hoạt tính đối kháng với vi khuẩn; Chủng R.palustris RD có khả năng sử dụng nguồn hữu cơ trong các nguồn nƣớc thải, cải thiện màu nƣớc.
Các chủng lựa chọn có đặc tính chịu mặn cao và an toàn đối với động vật thí nghiệm.
2.Xác định đƣợc các điều kiện tối ƣu trong lên men sản xuất chế phẩm - Môi trƣờng và điều kiện thích hợp để nhân giống B.subtilis DA là MPA3, nhiệt độ 28-370C, tỷ lệ giống từ 7,5%. Độ thông khí 130% oxy.
- Điều kiện nuôi cấy thích hợp với L.acidophillus TN là môi trƣờng MRS, nhiệt độ 340C, tỷ lệ giống 5-10%, độ thông khí 12-16/20 (lít)
- Điều kiện nuôi cấy tối ƣu để nhân giống R.palustris RD môi trƣờng SA bổ sung biotin, p-aminobenzoix acid, pH môi trƣờng 6-8,5. Nhiệt độ nuôi cấy 25-300, độ thông khí 12-16/20 (lít)
3.Tạo đƣợc chế phẩm probiotic từ sinh khối đó và bảo quản chế phẩm đó. - Lên men chìm tạo chế phẩm dạng dịch: L.acidophillus TN, B.subtilis DA, R.palustris RD đạt chất lƣợng 109 CFU/ml
- Lên men trên môi trƣờng xốp tạo chế phẩm dạng bột: L.acidophillus TN, B.subtilis DA đạt chất lƣợng 109 CFU/ml
- Đã xây dựng đƣợc công thức bảo quản chế phẩm trong thời gian 12 tháng. 4.Xây dựng đƣợc tiêu chuẩn cơ sở và quy trình kiểm nghiệm của chế phẩm probiotic
5. Xây dựng đƣợc quy trình sản xuất chế phẩm probiotic từ các chủng nghiên cứu
Kiến nghị
- Nghiên cứu thêm các thành phần bổ sung vào chế phẩm nhằm đa dạng hóa và nâng cao hiệu quả sử dụng sản phẩm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Nguyễn Chính (2004), “Một số suy nghĩ về vấn đề nuôi tôm sú (P.monodon) bền vững ở Việt Nam”, Tuyển tập Hội thảo toàn quốc về nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ trong nuôi trồng thủy sản Vũng Tàu, tr.75-78. 2. Nguyễn Tử Cƣơng (2005), Sổ tay hướng dẫn thực hành nuôi tốt tôm sú (GAP)
thâm canh ở Việt Nam, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội, tr.15-20.
3. Nguyễn Văn Hảo (2004), Một số bệnh thường gặp trên tôm sú (Pemacus monodon), các phương pháp chuẩn đoán và biện pháp phòng trị, Nxb Nông Nghiệp thành phố Hồ Chí Minh.
4. Phạm Thị Ngọc Lan (2012), Giáo trình thực tập vi sinh vật học, Nxb Đại học Huế.
5. Lê Thành Lựu (2004), “Thành tựu, thách thức, các định hƣớng và kiến nghị về công tác Khoa học công nghệ trong nuôi trồng thủy sản”, Tuyển tập Hội thảo toàn quốc về nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ trong nuôi trồng thủy sản, Vũng Tàu, tr.25-39.
6. Lƣơng Đức Phẩm (2002), Công nghệ xử lý nước thải bằng biện pháp sinh học, Nxb Giáo dục, tr.322-328.
7. Lƣơng Đức Phẩm (2004), Công nghệ vi sinh vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
8. Lê Xuân Sinh, Nguyễn Thị Phƣơng Nga (2004). “Những nhận xét cơ bản liên quan đến việc cung cấp và sử dụng hóa chất, thuốc trong nuôi trồng thủy sản ở Đồng Bằng sông Cửu Long”, Tuyển tập hội thảo toàn quốc về nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ trong nuôi trồng thủy sản, Vũng Tàu, tr.229-256.
9. Bùi Quang Tề, Lê Xuân Thành, Bùi Quang Mạnh (2004), “Nghiên cứu xây dựng giải pháp kỹ thuật nuôi tôm sú, cá basa và cá tra đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm”, Tuyển tập Hội thảo toàn quốc về nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ trong nuôi trồng thủy sản, Vũng Tàu, tr.117-132.
11.Nguyễn Văn Thành (2000), “Đánh giá trình độ công nghệ nuôi tôm bán thâm canh ở Việt Nam”, Các công trình nghiên cứu khoa học ngành thủy sản 1996-2000, tr.151-166.
12.Võ Thị Thứ (2003), “Đặc điểm sinh học của một số chủng Bacillus và
Lactobacillus có khả năng ứng dụng để xử lý môi trƣờng nuôi tôm cá”, Báo cáo khoa học, hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội, tr.388-391. 13.Võ Thị Thứ , Trƣơng Ba Hùng, Nguyễn Minh Dƣơng, La Thị Nga, Lệ Thị
Thu Hiền, Phạm Thị Minh Hà, Lê Doanh Toại, Nguyễn Trƣờng Sơn, Đào Thị Thanh Xuân, Nguyễn Liêu Ba (2004), “Nghiên cứu sử dụng Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus lichenifomis, Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm sinh học Biochie xử lý nƣớc nuôi thủy sản”, Tuyển tập Hội thảo toàn quốc về nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ trong nuôi trồng thủy sản,Vũng Tàu, tr.815-821.
Tiếng Anh
14. Aralampalam P.(1998), “Water quality and Bacterial populations in a Tropical marine eage culture farm”, In Aquaculture Reseach 29, pp.617-624.
15. Austin F., Stuckey L. S. (1995), A probiotic strains of Vibrio alginolyticus effective in reducing diseases cáued by Aeromonas salnimonicisa, Vibrio anguillarum and Vibrio ordallii, Journal of Fish Disease 18, pp.93-96.
16. Ian L. B., Kenneth J., Robert N. G. (2000), Probiotic compositions, US patent No: 6, 060, 050.
17. Fekelharing G., Van L. (2003), “Method of preparing a probiotic preparation”, Patent Cooperation Treaty (PCT): WO 03/085097.
18. Imhoff J.F., Truper H.G., and Pfennig N.(1984), “Rearrangement of the species and genera of the phototrophic purplr non – sunfur bacteria”., Int. J.Syst. Bacteriol. 34., pp.340-343
19. Keeton J. A., Williams D. P. (2003), Probiotic formulation and Method for reduction of Pathogenic bacteria US Pattent No: US 200310491.
20. Gordon R. E., Hayner W. C., Pang N. H. (1973), The genus Bacillus, United states Deparment of Agriculture Washington DC.
21. Gordon R. E (1981), One hundred and seven years of the genus Bacillus, The aerobic endospore forming bacteria, Clasification and identification: 1- 15 London Academic Press.
22. Molin G., Jeppsson B., Johansson L. M, Ahrne. S., Noback. S., Stahl. M. and Bengmark. S. (1993), Numerial Taxonomy of Lactobacillus sp, Associated with healthy and diseased of the human intestines
23. Logan Walter T, Barlett Stephen L (1998), Water treatment with larger numbers of nonpathogenic bacteria to improve yield of aquatic animals, US patent No: US 5746155
24. Mark O., Genadi B. (2001), Bacterial strain, prrocessed plant extracts, composition containing sam, processed for their preparation and their therapeutic and industrial application, US patent No: 2001/0001711A1.
25. Sirirat Dengripat et al (1998), Effects of probiotic bacterium on black tiger shimp penaeus monodon survival and growth, in Aquaculture167,pp.301-313.
26. Watson Brenda F., Watson T. S. (2002), Probiotic formulation, US patent No: US 6468525.
27. Fuller R. (1989), “Probiotics in man and animals”. J Appl Bacteriol, 66, pp. 65–78.
28. Fuller. R. (1992), “History and development of probiotics”, In: R. Fuller (Ed.) Probiotics: The Scientific Basis. pp 1−8.
29. Schillinger U. (1996), “Potential of antagonistic microorganisms and bacteriocins for the biological preservation of foods”, Trend in food Science and Technology, 64, pp. 158-164.
30. Pfenning N. (1969), “Rhodopseudomonas acidophila sp.n., a new species of budding nonsulffua bacteria”, J.bacteria. 99, pp.507-602.
Website
31.http://www.fistenet.gov.vn/e-nuoi-trong-thuy-san/b-nuoi-thuy-san/tinh-hinh- san-xuat-nuoi-trong-thuy-san-6-thang-111au-nam-2013/
PHỤ LỤC
Hình 1: Hình thái khuẩn lạc Bacillus subtillis trên thạch máu
Hình 2: Hình thái vi khuẩn Bacillus dƣới kính hiển vi ( phóng đại 1000 lần)
Hình 3: Hình thái khuẩn lạc L.acidophillus trên thạch MRS
Hình 5: Khả năng sinh Cellulase của B.lichenifomis (5), B.subtillis (6), L.acidophillus (7), B.megaterium (8)
Hình 6: Khả năng sinh Protease của B.subtilis DA, B.lichenifomis G1, B.megaterium PA
Hình 7: Khả năng sinh Amylase của B.lichenifomis (5), B.subtillis (6), L.acidophillus (7), Đối chứng dương (8)