Chƣơng 1 : TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1 Vật liệu nuôi cấy
Các chồi bánh tẻ thu từ cây vật liệu gốc 1 – 1,5 tuổi sinh trưởng tốt, không sâu bệnh đã được xử lý tạo chồi tại vườn ươm của Viện nghiên cứu Giống và công nghệ sinh học lâm nghiệp, P. Đức Thắng – Q. Bắc Từ Liêm, Hà Nội.
2.4.2 Địa điểm và điều kiện bố trí thí nghiệm
Địa điểm nghiên cứu: Tại Bộ môn Công nghệ tế bào thực vật- Viện nghiên cứu Giống và CNSH lâm nghiệp, thuộc Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam
Điều kiện thí nghiệm:
+ Số giờ chiếu sáng 10 - 12h/ngày
+ Cường độ chiếu sáng khoảng 2000- 3000Lux + Nhiệt độ phòng nuôi 25 ± 20
C
+ Các dụng cụ sử dụng và môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở điều kiện áp suất 1,2atm, nhiệt độ 120 – 1300C trong thời gian 20 – 40 phút.
+ Độ pH của môi trường nuôi cấy 5,6 – 5,8.
2.4.3 Phương pháp tiến hành
Áp dụng có cải tiến quy trình nhân giống bằng nuôi cấy mô bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cho các đối tượng cây rừng khác như các loài Bạch đàn, các loài Keo, Xoan, Tếch… đã được thực hiện thành công bởi nhóm cán bộ nghiên cứu thuộc Viện NC Giống và CNSH lâm nghiệp từ nhiều năm qua (theo Lê Đình Khả, Hà Huy Thịnh, Nguyễn Ngọc Tân, Đoàn Thị Mai). Phương pháp này bao gồm các bước được mô tả sau đây:
2.4.3.1 Phương pháp khử trùng
+ Vật liệu ban đầu là các đoạn chồi dài 10 -15cm được cắt vào buổi sáng và ngâm ngay vào trong nước để tránh hiện tượng mất nước.
+ Cắt bỏ lá rồi rửa mẫu vật dưới vòi nước chảy bằng chổi lông mềm + Vật liệu được rửa bằng chất tẩy nhẹ (nước rửa chén hay xà phòng), rồi rửa lại dưới vòi nước chảy.
+ Tráng qua nước cất
+ Tráng mẫu vật bằng cồn 70% trong khoảng 1phút sau đó tráng lại nước cất khử trùng 2 - 3 lần
+ Ngâm trong dung dịch khử trùng ở các khoảng thời gian khác nhau từ 2 – 20 phút tùy loại hóa chất tiếp đó dùng nước cất tráng lại 3 - 5 lần bằng nước cất đã được hấp khử trùng.
+ Dùng panh và dao cắt vật liệu thành các đoạn mẫu dài 2 - 4cm, có ít nhất 1 mắt ngủ rồi cấy vào môi trường tái sinh chồi ban đầu.
2.4.3.2 Tái sinh chồi ban đầu từ mẫu nuôi cấy
Tiến hành nuôi cấy trên các môi trường nuôi cấy thông dụng hay dùng trong nuôi cấy mô: WPM, MS, B5 có bổ sung 7g/l agar, 30g đường và độ pH của các môi trường được điều chỉnh trong khoảng 5,6 - 5,8.
2.4.3.3 Nhân chồi
Sau khi đã chọn được môi trường tái sinh chồi ban đầu tốt nhất, tiến hành các thí nghiệm ảnh hưởng riêng rẽ và phối hợp của các Cytokinin và Auxin để xác định môi trường nhân chồi tối ưu cho từng đối tượng nghiên cứu.
2.4.3.4 Tạo rễ và huấn luyện
Là giai đoạn chuyển mẫu nuôi cấy từ môi trường nhân nhanh chồi sang môi trường tạo rễ để có được cây hoàn chỉnh. Các chồi đạt tiêu chuẩn sẽ được nuôi cấy trong môi trường ra rễ sau đó được huấn luyện để thích nghi với điều kiện sống bên ngoài.