Chƣơng 1 : TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.5. Thành tựu của công nghệ nuôi cấy mô trong công tác nhân giống
lâm nghiệp
Những năm gần đây, việc sử dụng tiến bộ kỹ thuật mới về công nghệ tế bào thực vật trong công tác giống cây rừng đã được thực hiện tại nhiều nước trên thế giới như Thụy Điển, Úc, Braxin, Trung Quốc, Thái Lan...
Số lượng các loài Bạch đàn được nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy in vitro ngày càng tăng, đến năm 1987 đã có trên 20 loài Bạch đàn khác
nhau được nuôi cấy thành công. Các nhà khoa học ấn Độ thành công trong việc tạo cây mô từ các cây trội Bạch đàn Eucalyptus camandulensis, E. globulus, E. tereticornis, E. torelliana. Cây mô có nguồn gốc từ cây ưu việt
sinh trưởng nhanh gấp 3 lần và đồng đều hơn là cây mọc từ hạt của cùng cây mẹ.
Trung Quốc là một nước thành công trong việc tạo cây in vitro cho các loài cây thân gỗ. Đến nay đã có hơn 100 loài cây thân gỗ được nuôi cấy như Dương, Bạch đàn, Tếch, Bao đồng, … Trung Quốc là một trong những nước ứng dụng sớm và thành công nuôi cấy mô vào trồng rừng trên diện rộng. Từ năm 1991 ở vùng Nam Trung Quốc, người ta đã tạo ra trên 1 triệu cây mô của các cây và các dòng lai được chọn lọc. Những cây mô này được sử dụng cho trồng cây đầu dòng để tạo cây hom tại các vườn ươm địa phương và trực tiếp cho trồng rừng .
Tác giả Darus H. Ahmas, thuộc Viện nghiên cứu Lâm nghiệp Malaysia đã nuôi cấy in vitro cây Keo tai tượng (Acacia mangium) bằng môi trường MS có bổ sung 3 % sucrose, 0,6 % agar và 0,5 mg/l BAP cho giai đoạn nhân chồi. Những chồi có chiều cao trên 0,5 cm được cấy vào môi trường tạo rễ và chất điều hoà sinh trưởng tốt nhất cho tạo rễ là IBA 1000 ppm với tỷ lệ ra rễ là 40 %.
Các biện pháp nuôi cấy mô cũng đã được áp dụng cho cây Tếch (Tectona grandis). Gupta và các cộng sự (1979) đã mô tả sự hình thành cụm chồi từ phần cắt của cây non và từ mầm cây 100 tuổi. Từ đó họ có thể tạo
được 500 cây in vitro từ một chồi ở cây trưởng thành và 3000 cây từ một cây non trong một năm. Kaosaard (1990) cho biết Thái Lan cũng phát triển thành công kỹ thuật nuôi cấy mô vào năm 1986 cho cây Tếch và cho phép tạo ra 500.000 chồi từ một chồi trong một năm (Ikemori, Y.K.,1987). Perhutani (1991) đã thử nghiệm và nuôi cấy mô thành công đối với loài Tếch và một vài cây mô đã được đem trồng thử.
W. Nitiwattanachai và cộng sự (1990) đã nuôi cấy thành công cây keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Môi trường nhân nhanh chồi là MS (1962) + 10 μM BAP + 0,5 μM IBA, môi trường sử dụng cho ra rễ là White (1963) + 2 μM IBA + 1 μM NAA.
Nhiều loài cây lá rộng Châu Âu đã được thử nghiệm nhân giống thành công bằng phương pháp nuôi cấy mô như: Acer, Beluta, Fagus, Quercus, Carpinus... Các cây mô đã được trồng ra thực địa để so sánh và đã cho thấy chúng có kiểu hình tương đối giống nhau, tỷ lệ sống ở rừng trồng sau khi cây được huấn luyện là khá cao có thể đạt 90% đến 100% cho một số loài .
Nuôi cấy in vitro cũng là một biện pháp nhân giống được áp dụng
nhiều ở các loài cây lá kim nhằm phục vụ cho các chương trình trồng rừng dòng vô tính. Một số loài Thông đã được nuôi cấy thành công đó là Pinus nigra, P. caribaea, P. pinaster… Có tới 30 loài trong số các loài cây lá kim
được nghiên cứu nuôi cấy mô đã đạt được những thành công bước đầu, trong đó phải kể đến các loài Bách tán (Araucaria) Liễu sam (Cryptomeria
japonica) Bách xanh. Trong số 30 loài cây lá kim đã được nuôi cấy mô, có
bốn loài được đưa vào sản xuất trên diện rộng đó là Cù tùng (Sequoia
sempevirens) ở Pháp; Thông P. radiate ở Viện nghiên cứu Lâm nghiệp New
Dilân; Thông P. taeda và Pseudotsuga menziesii ở Mỹ. Phi lao cũng là một
so sánh với cây hạt trong nhà kính nhằm tạo cây mô Phi lao sinh trưởng nhanh, kháng bệnh và cố định đạm cao cho trồng rừng .
1.5.2. Trong nước
Những cơ sở hiện nay đang nhân giống bằng nuôi cấy mô ở quy mô lớn trong Lâm nghiệp nước ta là Viện nghiên cứu Giống và Công nghệ sinh học lâm nghiệp, Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy Phù Ninh, Công ty giống Lâm nghiệp Trung ương, Trung tâm khoa học sản xuất Lâm nghiệp Quảng Ninh, Xí nghiệp giống Thành phố Hồ Chí Minh, Trường đại học Lâm nghiệp, …vv. Hiện nay, một số tỉnh và địa phương đã thành lập phòng nuôi cấy mô để phục vụ cho công tác giống cây trồng và đạt được những thành công bước đầu.
Nuôi cấy mô ở nước ta đã áp dụng rộng rãi trong công tác nhân giống một số giống Bạch đàn nhập nội, các dòng vô tính Bạch đàn lai và Keo lai có năng suất cao. Cùng với những kết quả về cải thiện giống Viện nghiên cứu Giống và công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã nghiên cứu thành công kỹ thuật nuôi cấy in vitro cho Keo lai, Bạch đàn và một số giống cây rừng khác .
Dương Mộng Hùng (1993) nghiên cứu bằng nuôi cấy mô cho hai loài Bạch đàn E. camaldulensis và E. urophylla từ cây trội của 2 loài đã tạo được
một số cây mô Bạch đàn với hệ số nhân chồi là 1-2 lần.
Đoàn Thị Mai và cộng sự (2000) đã nghiên cứu nuôi cấy mô thành công cho giống Bạch đàn lai U29C3 . Kết quả cho thấy thời kỳ mẫu bị nhiễm ít nhất và có tỷ lệ bật chồi cao nhất là từ tháng 5 đến tháng 8. Môi trường MS có bổ sung 0,5mg/l BAP cho số chồi trung bình trong mỗi cụm cao nhất (16,6 chồi/cụm). Môi trường ra rễ thích hợp là môi trường MS bổ sung 1,0mg/l IBA cho tỷ lệ ra rễ tới 83,8%.
Vũ Ngọc Phượng và cộng sự (Viện sinh học nhiệt đới) năm 2002 đã công bố nghiên cứu nhân giống in vitro thành công cho cây Tre tàu
(Sinocalamus latiflorus) và Tre mạnh tông (Dendrocalamus asper). Mẫu vật được lấy từ hạt và được khử trùng bằng Ca(OCl)2 (hypoclorit canxi) trong 15 phút và HgCl2 trong 5 phút. Nghiên cứu tiến hành với nhiều công thức thí nghiệm và thu được kết quả là: Tạo chồi từ hạt tốt trên môi trường MS có bổ sung BAP 3 mg/l và Kinetin 1 mg/l. Môi trường thích hợp cho nhân chồi là môi trường MS bổ sung BAP 2 mg/l và Kinetin 1 mg/l. Môi trường ra rễ là ½MS có bổ sung IBA 10mg/l.
Đoàn Thị Mai và cộng sự, 2005 đã đưa ra môi trường nhân chồi thức hợp cho cây Trầm là môi trường MS cải tiến bổ sung 1,0mg/l BAP + 0,5 mg/l Kinetin. Môi trường ra rễ thích hợp nhất là môi trường ½MS cải tiến có bổ sung 2,0 mg/l IBA..
Đoàn Thị Ái Thuyền và cộng sự (2005) đã nhân giống thành công cây Hông bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào. Mẫu được khử trùng bằng Ca(OCl)2 (Hypoclorit canxi) trong 20 phút sau đó cho cấy vào các môi trường khác nhau. Kết quả thu được như sau: môi trường thích hợp nhất cho tạo chồi và nhân nhanh chồi là môi trường MS cải tiến có bổ sung 30 g/l đường + 8 g/l Agar + 5 mg/l BAP và 0,1 mg/l NAA. Môi trường tạo rễ và cây con hoàn chỉnh tối ưu là ½MS + 20 g/l đường + 0,1 mg/l NAA + 1,0 g/l than hoạt tính.
Đoàn Thị Nga, thuộc viện nghiên cứu nguyên liệu giấy Phù Ninh - Phú Thọ nghiên cứu nuôi cấy mô cây bạch đàn dòng PN2. Môi trường nhân nhanh thích hợp là MS + 0,5mg/l BAP + 0,25mg/l NAA; môi trường ra rễ tối ưu là : 1/4MS + 1mg/l IBA
Hồ Văn Giảng và cộng sự, 2006 đã bước đầu xây dựng quy trình nhân giống cây Dó bầu bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào. Môi trường thích hợp nhất cho nhân chồi là MS cải tiến + 0,3 mg/l BAP + 20 g đường + 6 g/l agar cho hệ số nhân chồi đạt 4,2 chồi/ cụm. Môi trường ra rễ thích hợp nhất là
WPM + 0,3 mg/l NAA + 20 g/l đường + 6 g/l agar cho tỷ lệ ra rễ đạt 88,7% và cây mô sống đạt 98% khi đưa ra ngoài.
Đoàn Thị Mai và cộng sự, 2010 nghiên cứu thành công quy trình nhân giống cho Keo lai( Keo lai tự nhiên và Keo lai nhân tạo), Bạch đàn và Lát hoa. Đối với Keo lai môi trường nhân chồi : MS* + 1,5 mg/l BAP; môi trường tiền ra rễ : MS* + 1,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA; Môi trường ra rễ tối ưu: 1/2MS + 1,5 mg/l IBA.
Với Bạch đàn có môi trường nhân chồi là MS* + 0,5 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA; môi trường ra rễ tối ưu là: 1/2MS + 1,5 mg/l IBA + 0,1 mg/l ABT1.
Tuy nhiên, do cây rừng có chu kỳ sống dài ngày, hệ gen phức tạp, phản ứng của các kiểu gen rất khác nhau đối với cùng một điều kiện môi trường nên trong cùng một loài, với các dòng khác nhau thì hiệu quả nhân giống cũng rất khác nhau. Vì vậy, nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro nhằm
tối ưu hoá kỹ thuật và môi trường từ khâu khử trùng, nhân chồi, ra rễ đến điều kiện nuôi cấy... cho từng đối tượng loài/ dòng cụ thể là cần thiết và là mục tiêu nghiên cứu của đề tài. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn to lớn trong việc phát triển các giống mới đã qua lai tạo và chọn lọc vào sản xuất.
Chƣơng 2
MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mục tiêu nghiên cứu
2.1.1 Mục tiêu chung
Nhằm góp phần hoàn thiện quy trình nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào cho các dòng bạch đàn lai mới được công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật, làm cơ sở để phát triển và gây trồng rộng rãi ở các vùng sinh thái thích hợp trong cả nước.
2.1.2 Mục tiêu cụ thể
- Xác định được môi trường phù hợp để nhân giống hai dòng Bạch đàn lai: UP54 và UP99 bằng phương pháp nuôi cấy mô.
- Tạo ra cây con hoàn chỉnh cho hai dòng Bạch đàn lai: UP54 và UP99 bằng phương pháp nuôi cấy mô.
2.2 Đối tƣợng nghiên cứu
Hai dòng bạch đàn lai sinh trưởng nhanh là: UP54 và UP99
2.3 Nội dung nghiên cứu
Để đạt được mục tiêu nghiên cứu trên, đề tài thực hiện các nội dung nghiên cứu sau:
- Nghiên cứu phương pháp khử trùng: loại hóa chất, nồng độ, thời gian và mùa vụ thích hợp.
- Nghiên cứu môi trường nuôi cấy cơ bản và chế độ nuôi thích hợp. - Nghiên cứu môi trường nhân chồi thích hợp.
- Nghiên cứu môi trường ra rễ tối ưu và phương pháp huấn luyện, mùa vụ thích hợp để đưa cây từ nuôi cấy mô ra vườn ươm.
2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1 Vật liệu nuôi cấy
Các chồi bánh tẻ thu từ cây vật liệu gốc 1 – 1,5 tuổi sinh trưởng tốt, không sâu bệnh đã được xử lý tạo chồi tại vườn ươm của Viện nghiên cứu Giống và công nghệ sinh học lâm nghiệp, P. Đức Thắng – Q. Bắc Từ Liêm, Hà Nội.
2.4.2 Địa điểm và điều kiện bố trí thí nghiệm
Địa điểm nghiên cứu: Tại Bộ môn Công nghệ tế bào thực vật- Viện nghiên cứu Giống và CNSH lâm nghiệp, thuộc Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam
Điều kiện thí nghiệm:
+ Số giờ chiếu sáng 10 - 12h/ngày
+ Cường độ chiếu sáng khoảng 2000- 3000Lux + Nhiệt độ phòng nuôi 25 ± 20
C
+ Các dụng cụ sử dụng và môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở điều kiện áp suất 1,2atm, nhiệt độ 120 – 1300C trong thời gian 20 – 40 phút.
+ Độ pH của môi trường nuôi cấy 5,6 – 5,8.
2.4.3 Phương pháp tiến hành
Áp dụng có cải tiến quy trình nhân giống bằng nuôi cấy mô bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cho các đối tượng cây rừng khác như các loài Bạch đàn, các loài Keo, Xoan, Tếch… đã được thực hiện thành công bởi nhóm cán bộ nghiên cứu thuộc Viện NC Giống và CNSH lâm nghiệp từ nhiều năm qua (theo Lê Đình Khả, Hà Huy Thịnh, Nguyễn Ngọc Tân, Đoàn Thị Mai). Phương pháp này bao gồm các bước được mô tả sau đây:
2.4.3.1 Phương pháp khử trùng
+ Vật liệu ban đầu là các đoạn chồi dài 10 -15cm được cắt vào buổi sáng và ngâm ngay vào trong nước để tránh hiện tượng mất nước.
+ Cắt bỏ lá rồi rửa mẫu vật dưới vòi nước chảy bằng chổi lông mềm + Vật liệu được rửa bằng chất tẩy nhẹ (nước rửa chén hay xà phòng), rồi rửa lại dưới vòi nước chảy.
+ Tráng qua nước cất
+ Tráng mẫu vật bằng cồn 70% trong khoảng 1phút sau đó tráng lại nước cất khử trùng 2 - 3 lần
+ Ngâm trong dung dịch khử trùng ở các khoảng thời gian khác nhau từ 2 – 20 phút tùy loại hóa chất tiếp đó dùng nước cất tráng lại 3 - 5 lần bằng nước cất đã được hấp khử trùng.
+ Dùng panh và dao cắt vật liệu thành các đoạn mẫu dài 2 - 4cm, có ít nhất 1 mắt ngủ rồi cấy vào môi trường tái sinh chồi ban đầu.
2.4.3.2 Tái sinh chồi ban đầu từ mẫu nuôi cấy
Tiến hành nuôi cấy trên các môi trường nuôi cấy thông dụng hay dùng trong nuôi cấy mô: WPM, MS, B5 có bổ sung 7g/l agar, 30g đường và độ pH của các môi trường được điều chỉnh trong khoảng 5,6 - 5,8.
2.4.3.3 Nhân chồi
Sau khi đã chọn được môi trường tái sinh chồi ban đầu tốt nhất, tiến hành các thí nghiệm ảnh hưởng riêng rẽ và phối hợp của các Cytokinin và Auxin để xác định môi trường nhân chồi tối ưu cho từng đối tượng nghiên cứu.
2.4.3.4 Tạo rễ và huấn luyện
Là giai đoạn chuyển mẫu nuôi cấy từ môi trường nhân nhanh chồi sang môi trường tạo rễ để có được cây hoàn chỉnh. Các chồi đạt tiêu chuẩn sẽ được nuôi cấy trong môi trường ra rễ sau đó được huấn luyện để thích nghi với điều kiện sống bên ngoài.
2.5 Các bƣớc nhân giống in vitro cho Bạch đàn lai UP54 và UP99
Đề tài thực hiện các bước nhân giống bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cho hai dòng Bạch đàn lai UP54 và UP99 theo sơ đồ sau:
Dòng tuyển chọn
(UP54 và UP99) ↓↓
Mẫu nuôi cấy ban đầu
(Khử trùng mẫu bằng HgCl2 ở các nồng độ và thời gian khác nhau) ↓↓
Tạo chồi ban đầu
(Xác định môi trường tái sinh chồi thích hợp) ↓↓
Nhân chồi
(Xác định môi trường nhân chồi thích hợp, bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng)
↓↓
Tạo rễ
(Xác định môi trường ra rễ hiệu quả) ↓↓
Cây con vƣờn ƣơm
(Phương pháp huấn luyện cây mầm)
Sơ đồ: Các giai đoạn trong quá trình nhân giống cho bạch đàn lai UP54 và UP99
2.5.1 Các công thức thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Xác định phương pháp khử trùng thích hợp cho 2 dòng bạch
Các thí nghiệm bố trí với 3 lần lặp, 45 mẫu/ lặp, các mẫu được quan sát hàng ngày trong tuần.
Ảnh hưởng của hóa chất, nồng độ và thời gian tới kết quả khử trùng:
Thí nghiệm được tiến hành với 2 loại hoá chất là HgCl2 và Ca(ClO)2, ở các nồng độ và thời gian khác nhau.
Ảnh hưởng của thời điểm lấy mẫu trong năm tới kết quả khử trùng:
Thí nghiệm tiến hành lấy mẫu vào các tháng 1-3; 4-6; 7-9; 10-12 trong năm theo bốn mùa: Xuân, hạ, thu, đông
Thí nghiệm 2: Xác định môi trường tái sinh chồi ban đầu cho 2 dòng bạch
đàn lai UP54 và UP99
Thí nghiệm được tiến hành trên 3 loại môi trường có bổ sung 30 g/l đường và 3,7g/l thạch, không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, bố trí ba công thức với 3 lần lặp, 45 mẫu/ lặp.
Công thức 1: Môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) Công thức 2: Môi trường B5 (Gamborg)
Công thức 3: Môi trường WPM (Woody Plant Medium, 1980)
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của chế độ nuôi sáng - tối tới kết quả nhân chồi
cho 2 dòng bạch đàn lai UP54 và UP99
Từ môi trường nuôi cấy cơ bản tốt nhất đã được xác đinh và ở điều kiện thí nghiệm với số giờ chiếu sáng 10-12 giờ/ngày, đề tài tiến hành các thí nghiệm với 3 lần lặp, 45 mẫu/lặp cùng các chỉ tiêu theo dõi: chiều dài chồi (cm) và số chồi /cụm theo 5 công thức sau:
CĐ1 : Chiếu sáng hoàn toàn
CĐ2(1:1:1) : 5 ngày sáng : 5 ngày tối : 5 ngày sáng CĐ3( 1:2:2) : 3 ngày sáng : 6 ngày tối : 6 ngày sáng CĐ4(1 :2 :1): 4 ngày sáng : 8 ngày tối : 4 ngày sáng CĐ5 : Tối hoàn toàn
Thí nghiệm 4: Xác định môi trường nhân nhanh số lượng chồi cho 2 dòng