Đặc điểm sinh hóa
Bảng 1.2. Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis (Nguyễn Đức Lƣợng. 2002)
Phản ứng sinh hóa Kết quả Phản ứng sinh hóa Kết quả
Hoạt tính catalase + Phân giải tinh bột +
Sinh indol - Arabinose +
MR (Metyl red) + Xylose +
VP (Voges-Proskauer) + Saccharose +
Sử dụng citrate + Manitol +
Khử nitrate + Glucose +
Tan chảy gelatin + Lactose -
Di động + Maltose +
Đặc điểm nuôi cấy
Vi khuẩn B. subtilis phát triển trong điều kiện hiếu khí, tuy nhiên chúng vẫn
phát triển đƣợc trong MT thiếu oxy. Nhiệt độ tối ƣu là 37 oC, pH thích hợp khoảng 7,0 - 7,4.
Vi khuẩn phát triển trên hầu hết trên các môi trƣờng dinh dƣỡng cơ bản: - Trên môi trƣờng thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA): khuẩn lạc dạng tròn,
bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu.
- Trên môi trƣờng canh Trypticase Soy Broth (TSB): vi khuẩn phát triển làm đục môi trƣờng, tạo màng nhăn, lắng cặn, kết lại nhƣ vẩn mây ở đáy, khó tan khi lắc đều.
- Trên môi trƣờng giá đậu - peptone: khuẩn lạc dạng tròn lồi, nhẵn bóng, đôi khi lan rộng, rìa răng cƣa không đều, đƣờng kính 3 – 4 mm sau 72 giờ nuôi cấy.
- Nhu cầu dinh dƣỡng: Để phát triển, B. subtilis chủ yếu cần các nguyên tố C, H, O, N và một số nguyên tố vi lƣợng khác. Chúng phát triển tốt trong môi trƣờng cung cấp đủ nguồn carbon (nhƣ glucose) và nitơ (nhƣ peptone). 1.2.1.5. Bào tử và khả năng tạo bào tử
Hình 1.5. Quá trình Bacillus subtilis sinh nội bào tử quan sát dƣới kính hiển vi
Bào tử là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hóa học cơ bản nhƣ ở tế bào sinh dƣỡng nhƣng có một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thành phần và có thêm một số thành phần mới. Bào tử B. subtilis có dạng elip đến hình
cầu, có kích thƣớc 0,6 - 0,9 µm x 1,0 -1,5 µm, đƣợc bao bọc bởi nhiều lớp màng với các thành phần lipoprotein, peptidoglycan... Bào tử của chúng có khả năng chịu đƣợc pH thấp của dạ dày, đây là đặc điểm quan trọng trong ứng dụng sản xuất probiotic từ B. subtilis (Hajati và Rezaei, 2010).
Bào tử có khả năng chịu nhiệt (ở 100 oC trong 180 phút), chịu sấy khô, chịu bức xạ, thuốc khử trùng… cũng nhƣ các điều kiện khác mà thông thƣờng vi khuẩn sẽ bị tiêu diệt. Nhờ khả năng tạo bào tử mà vi khuẩn có thể tồn tại đƣợc trong các điều kiện bất lợi (dinh dƣỡng trong môi trƣờng cạn kiệt, môi trƣờng tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có hại và nhiệt độ cao…) bằng cách lƣu trữ các nhiễm sắc thể trong lõi của bào tử và tồn tại tới khi điều kiện thuận lợi.
1.2.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp protease ở Bacillus subtilis
1.2.2.1. Ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng
Số lƣợng, chủng loại và tỷ lệ các thành phần dinh dƣỡng của môi trƣờng có ý nghĩa quyết định đến khả năng sinh tổng hợp protease ở vi sinh vật nói chung, B.
subtilis nói riêng. Để tăng lƣợng protease trong môi trƣờng cần lựa chọn nguồn
carbon, nitrogen, muối khoáng với tỷ lệ thích hợp và đặc biệt nguồn cơ chất cảm ứng cần đƣợc lựa chọn kỹ lƣỡng.
Nguồn carbon
Nguồn carbon thƣờng dùng để nuôi cấy vi sinh vật là các glucid: monosaccharide, disaccharide và polysaccharide (tinh bột). Tác dụng của nguồn carbon phụ thuộc vào bản chất hóa học của chúng và đặc tính sinh lý của vi sinh vật. Nguồn carbon tự nhiên thƣờng dùng trong môi trƣờng nuôi cấy là bột mì, bột đậu tƣơng, cám hoặc nƣớc chiết của nguyên liệu này
Tinh bột là nguồn carbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp protease trong đó có B. subtilis. B. subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease khi môi
trƣờng chứa lƣợng tinh bột lớn hơn 8%. Glucose, saccharose, maltose, fructose và sorbitol đều là nguồn carbon tốt cho sự tổng hợp protease ở vi khuẩn này (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002).
Khi nghiên cứu ảnh hƣởng của nguồn carbon lên khả năng sinh protease của
B. subtilis bằng cách bổ sung các thành phần khác nhau nhƣ tinh bột hòa tan,
maltose, lactose, saccharose và dextrose với nồng độ 0,5% vào môi trƣờng cơ bản (thịt-peptone), đồng thời khảo sát trên mẫu đối chứng và tiến hành nuôi cấy thu enzyme thô, xác định hoạt tính enzyme; các tác giả Đỗ Thị Bích Thủy và Trần Thị Xô (2004) nhận thấy tinh bột hòa tan là nguồn carbon giúp B. subtilis sinh tổng hợp protease tốt nhất và cho rằng tinh bột trong môi trƣờng đã kích thích chủng này sinh amylase. Chính amylase này là chất cảm ứng sinh protease. Tuy nhiên, khi khảo sát ảnh hƣởng của nguồn carbon lên khả năng sinh protease của một chủng Bacillus sp., Mehrotra và cs (1999) lại công bố rằng tinh bột không có vai trò kích thích. Trong khi đó, lactose, saccharose, dextrose kìm hãm khả năng sinh protease của chủng vi khuẩn này.
Nguồn nitơ
Nguồn nitơ trong môi trƣờng nuôi cấy có thể là các chất hữu cơ (protein và các sản phẩm thuỷ phân của protein) hoặc các muối vô cơ chứa nitơ (amoni, nitrat).
Nguồn nitơ hữu cơ thƣờng thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp protease của B. subtilis vì chúng có vai trò nhƣ chất cảm ứng của quá trình này. Các nguồn nitơ hữu cơ thƣờng dùng là: pepton, casein, albumin, bột đậu tƣơng... Trong số đó, peptone ở nồng độ thấp thƣờng là chất cảm ứng tốt nhất cho quá trình sinh tổng hợp protease. Thay thế peptone bằng casein sẽ làm giảm rõ rệt lƣợng protease đƣợc tổng hợp nhất là khi casein ở nồng độ cao.
Nguồn nitơ vô cơ tốt nhất cho vi khuẩn thƣờng là (NH4)2SO4. Các muối clorua, sulphate, nitrate amon thƣờng có ảnh hƣởng không tốt đến quá trình sinh tổng hợp protease.
Đối với B. subtilis việc sử dụng phối hợp nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ sẽ làm tăng đáng kể quá trình tổng hợp protease của chúng (Trần Ngọc Hùng, 2010)
Các nguyên tố khoáng đa lượng và vi lượng
Các hợp chất khoáng có ý nghĩa rất lớn trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật nói chung và B. subtilis nói riêng vì chúng làm thay đổi trạng thái hoá keo của tế bào
chất. Trong đó, phospho và lƣu huỳnh có ảnh hƣởng đáng kể đến quá trình sinh tổng hợp protease. Các photphate vô cơ có ảnh hƣởng không tốt đến sự sinh tổng hợp protease. Tuy nhiên, KH2PO4 thƣờng thúc đẩy đến quá trình sinh tổng hợp protease do tính chất đệm của nó. Lƣu huỳnh có ảnh hƣởng khác nhau, giữ vai trò điều hòa quá trình tổng hợp protease của vi sinh vật (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
Các vi sinh vật có thể lấy một số các chất khoáng khác nhƣ magiê, natri, sắt… thông qua một số dạng muối khoáng đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy hoặc có sẵn trong nguyên liệu pha môi trƣờng.
Cơ chất cảm ứng sinh tổng hợp protease
Trong số các enzyme do vi sinh vật tổng hợp, một số enzyme đƣợc tổng hợp với một lƣợng rất ít trong điều kiện thƣờng, nhƣng hàm lƣợng của chúng có thể tăng gấp nhiều lần khi chúng ta cho thêm một số hợp chất nhất định vào môi trƣờng nuôi cấy. Các enzyme này đƣợc gọi là các enzyme cảm ứng. Chất gây nên hiệu ứng này là chất cảm ứng. Nhƣ vậy có thể xem chất cảm ứng là cơ chất đặc hiệu của enzyme hay những chất tƣơng tự nhƣ cơ chất hoặc những sản phẩm trung gian của quá trình biến đổi các chất (Mayday và cs, 1986).
Khả năng sinh tổng hợp protease của B. subtilis thƣờng đƣợc cảm ứng bởi các chất giàu đạm nhƣ bột đậu nành, đậu phộng, bột cá, bột tôm, bột nghiền móng, sừng hoặc lông vũ... Tuy nhiên, đối với các loại cơ chất khác nhau thì hoạt độ enzyme cũng thể hiện không giống nhau. Do đó, trong môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật có
thể lựa chọn bổ sung các cơ chất thích hợp nhằm thu lƣợng lớn protease cần thiết một cách nhanh chóng và khoa học (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004)
1.2.2.2. Ảnh hƣởng của yếu tố môi trƣờng lên khả năng sinh tổng hợp protease Nhiệt độ Nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hƣởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi khuẩn cũng nhƣ tính chất của enzyme đƣợc tổng hợp. Mỗi chủng vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp khác nhau. Tuy nhiên, đa số các vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme đều không bền với nhiệt độ và bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp. Nhiệt độ tối ƣu của B. subtilis sinh tổng hợp enzyme protease là 37 oC.
pH môi trường
Khi dùng phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt, pH của môi trƣờng thƣờng ít ảnh hƣởng đến quá trình tổng hợp enzyme ở vi sinh vật vì môi trƣờng bán rắn có tính đệm cao và hầu nhƣ không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật. Thông thƣờng, các vi khuẩn phát triển tốt và tạo nhiều enzyme ở pH trung tính 6,6 – 7,4 (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
Khi dùng phƣơng pháp nuôi cấy chìm, pH có ảnh hƣởng rất lớn đến sự tích lũy protease trong môi trƣờng. pH của môi trƣờng thay đổi sau khi thanh trùng môi trƣờng và đặc biệt thay đổi rất lớn trong quá trình nuôi cấy, pH ban đầu thích hợp cho phát triển của vi khuẩn khoảng 6,2 – 7,4. Trong quá trình nuôi cấy, tùy theo thành phần môi trƣờng và các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật, mà pH của môi trƣờng sẽ chuyển dần về phía axit hoặc kiềm.
Đối với các loài thuộc chi Bacillus, pH thƣờng chuyển về kiềm. Ngƣời ta có
thể căn cứ vào pH của môi trƣờng sau khi nuôi cấy để dự đoán lƣợng protease tích lũy trong môi trƣờng. Nhiều nghiên cứu cho thấy pH của môi trƣờng ảnh hƣởng tới tỷ lệ giữa các protease đƣợc tổng hợp. Do đó, nếu giữ pH của môi trƣờng ổn định trong suốt thời gian nuôi cấy, B. subtilis sẽ tạo một loại protease xác định chiếm ƣu thế trong môi trƣờng (Lê Ngọc Tú và cs, 1989; Ahn và cs, 1993)
Thời gian nuôi cấy
Các chủng vi sinh vật khác nhau có tốc độ sinh trƣởng khác nhau. Tốc độ sinh trƣởng của vi sinh vật trong đó có B. subtilis thƣờng liên quan đến thời gian nuôi
cấy và là yếu tố có vai trò rất quan trọng trong việc sinh tổng hợp enzyme. Mặt khác, yếu tố thời gian còn quyết định năng suất của việc sản xuất chế phẩm enzyme.
Thông thƣờng, enzyme đƣợc tổng hợp nhiều nhất trong môi trƣờng nuôi cấy tại một thời điểm nhất định. Ngoài ra, thời gian nuôi cấy còn phụ thuộc vào chủng giống, thành phần môi trƣờng, điều kiện nuôi cấy.
Độ thông khí
Oxy rất cần đối với đời sống vi sinh vật hiếu khí. Tăng sự thông khí đến giới hạn xác định thì sự phát triển của vi sinh vật cũng tăng theo. Đối với nhiều vi sinh vật, thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinh trƣởng, rút ngắn pha tiềm phát và nâng cao sinh khối. Lƣợng oxy thích hợp cho quá trình tổng hợp protease của các vi sinh vật khác nhau. Trong một số trƣờng hợp thiếu oxy tuy có kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật nhƣng lại tăng quá trình tổng hợp protease. Sự hiếu khí mạnh làm kìm hãm sự tổng hợp protease (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004)
1.2.2.3. Ảnh hƣởng của phƣơng pháp nuôi cấy
Ngoài nguồn dinh dƣỡng và yếu tố môi trƣờng thì phƣơng pháp nuôi cấy cũng ảnh hƣởng đáng kể tới sinh tổng hợp protease ở Bacillus. Để thu nhận chế phẩm
enzyme có thể dùng hai phƣơng pháp nuôi cấy: phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt (phƣơng pháp nổi) và phƣơng pháp bề sâu (phƣơng pháp chìm) (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
Protease từ Bacillus sp. sản xuất dù theo phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt hay
phƣơng pháp bề sâu đều có pH và nhiệt độ hoạt động tối ƣu tƣơng tự nhau, tuy nhiên việc nuôi cấy bề mặt cho protease có độ bền với nhiệt độ và pH cao hơn so với nuôi cấy bề sâu (Nascimento và Martin, 2004).
1.3. PHƢƠNG PHÁP TĂNG CƢỜNG SẢN XUẤT SẢN PHẨM THỨ CẤP (PROTEASE) VÀ CÔNG NGHỆ RIBOSOME (PROTEASE) VÀ CÔNG NGHỆ RIBOSOME
Hiện nay, 4 chiến lƣợc chính đang đƣợc sử dụng phổ biến để tăng cƣờng sản xuất sản phẩm thứ cấp là: công nghệ đáp ứng lại của vi sinh vật, công nghệ gen, công nghệ trao đổi chất và công nghệ ribosome (Davati và cs, 2013). Trong đó hai công nghệ gen và công nghệ ribosome có nhiều triển vọng ứng dụng trong việc tạo ra các chủng vi sinh vật có sản lƣợng tổng hợp protease cao.
1.3.1. Công nghệ đáp ứng lại của VSV
Các yếu tố trong môi trƣờng lên men làm vi sinh vật tăng hoặc giảm tổng hợp sản phẩm thứ cấp. Các yếu tố này hoặc có bản chất phi sinh học nhƣ nguồn N, C…giá trị pH, nhiệt độ… hoặc có bản chất sinh học nhƣ sự đáp ứng lại của tế bào này với các tế bào khác trong cùng môi trƣờng khi mật độ tế bào đủ lớn (hiện tƣợng
cảm ứng mật độ – Quorum sensing) (Zak và cs, 2011). Hệ quả của hiện tƣợng cảm ứng mật độ làm cho lƣợng sản phẩm thứ cấp tăng lên nhanh chóng vì các tế bào đáp ứng với nhau thông qua việc giải phóng các tín hiệu hóa học (sản phẩm thứ cấp) (Raina và cs, 2011). Chiến lƣợc này đƣợc ứng dụng từ thập niên 70 của thế kỉ XX cho đến nay, nhằm mục đích tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy các chủng vi sinh vật mới phân lập hoặc để tăng cƣờng sản xuất những sản phẩm thứ cấp mà không làm cải biến di truyền. Một ví dụ cho chiến lƣợc này là nghiên cứu của Zak và cộng sự thay đổi nguồn carbonhydrat và nitơ trong môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật thông thƣờng để tối ƣu hóa thành phần dinh dƣỡng cho các chủng vi sinh vật đƣợc phân lập từ đất (Zak và cs, 2011).
1.3.2. Công nghệ gen
Trong công nghệ gen, có hai phƣơng pháp chính làm tăng lƣợng sản phẩm thứ cấp là gây đột biến và tái tổ hợp di truyền (Barrios và cs, 2003).
1.3.2.1. Phƣơng pháp gây đột biến
Tạo các thể đột biến từ các chủng tự nhiên thực chất là chiến lƣợc tăng cƣờng sản xuất các sản phẩm sơ cấp và thứ cấp, có thể tạo ra các thể đột biến có khả năng sinh kháng sinh cao hơn các chủng thuần từ 15 – 400 lần (Malik, 1979).
Đột biến ngẫu nhiên
Sau khi tạo ra thể đột biến nhờ các tác nhân vật lý, hóa học khác nhau nhƣ tia UV, tia X, tia gamma, N – methyl – N – nitro – N – nitrosoguanidine, ethyl ethanesulphonate…, các thể đột biến đƣợc sàng lọc, tìm kiếm ra thể đột biến ƣu việt hơn so với chủng thuần về một thuộc tính nào đó. Phƣơng pháp này khá đơn giản, không yêu cầu trang thiết bị hiện đại, hạn chế thao tác kỹ thuật khó tuy nhiên rất tốn thời gian và công sức (Davati và cs, 2013).
Đột biến định hướng
Sau khi sử dụng các tác nhân đột biến, các thể đột biến mang các kiểu gen mong muốn đƣợc sàng lọc định hƣớng và bỏ qua các kiểu gen khác. Phƣơng pháp này cho phép phân lập dễ dàng hơn so với phƣơng pháp gây đột biến ngẫu nhiên. Tuy nhiên, khi tiến hành thí nghiệm cần phải có những hiểu biết cơ bản về quá trình chuyển hóa thành sản phẩm và các con đƣờng liên quan (Barrios và cs, 2003).
Thành công đầu tiên khi sử dụng phƣơng pháp này là tạo ra thể đột biến sản xuất penicillin hàm lƣợng cao, Penicillium chrysogenum X – 1612, nhờ chiếu tia X (Hersbach và cs, 1984). Kế tiếp đó là chủng đột biến Aspergillus nidulans có khả
năng sản xuất penicillin tăng 70 – 95% so với chủng ban đầu (Simpson và Caten, 1979).
1.3.2.2. Tái tổ hợp di truyền
Chiến lƣợc chính đƣợc sử dụng để cải biến di truyền phân tử nhằm tăng sản lƣợng sản phẩm thứ cấp bao gồm (Barrios và cs, 2003):
(1) Tăng số bản copy gen sinh tổng hợp sản phẩm: gen đích sau khi đƣợc nhân bản sẽ đƣợc chèn vào vector. Tiếp đó, vector này đƣợc biến nạp vào vi sinh vật. Nhờ vậy, gen đích đƣợc cài vào nhiễm sắc thể vật chủ thông qua trao đổi chéo tƣơng đồng (Baltz, 1998). Nghiên cứu cho thấy khi nhân đôi gen tylF
mã hóa cho tylosin và biến nạp vào Streptomyces fradiae thì lƣợng sản phẩm chủng tái tổ hợp tăng 60% so với chủng thuần (Baltz, 1998).
(2) Bất hoạt con đƣờng cạnh tranh: phá hủy gen làm cho tiền chất biến đổi thành sản phẩm khác cạnh tranh với sản phẩm mong muốn. Nghiên cứu của Casqueiro và cộng sự đã chứng minh nếu phá hủy gen lys2 liên quan tới quá trình biến đổi từ tiền chất α – amino acid của penicillin thành sản phẩm cạnh tranh lysine thì lƣợng penicillin tăng lên 100% so với chủng ban đầu