Số lƣợng, chủng loại và tỷ lệ các thành phần dinh dƣỡng của môi trƣờng có ý nghĩa quyết định đến khả năng sinh tổng hợp protease ở vi sinh vật nói chung, B.
subtilis nói riêng. Để tăng lƣợng protease trong môi trƣờng cần lựa chọn nguồn
carbon, nitrogen, muối khoáng với tỷ lệ thích hợp và đặc biệt nguồn cơ chất cảm ứng cần đƣợc lựa chọn kỹ lƣỡng.
Nguồn carbon
Nguồn carbon thƣờng dùng để nuôi cấy vi sinh vật là các glucid: monosaccharide, disaccharide và polysaccharide (tinh bột). Tác dụng của nguồn carbon phụ thuộc vào bản chất hóa học của chúng và đặc tính sinh lý của vi sinh vật. Nguồn carbon tự nhiên thƣờng dùng trong môi trƣờng nuôi cấy là bột mì, bột đậu tƣơng, cám hoặc nƣớc chiết của nguyên liệu này
Tinh bột là nguồn carbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp protease trong đó có B. subtilis. B. subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease khi môi
trƣờng chứa lƣợng tinh bột lớn hơn 8%. Glucose, saccharose, maltose, fructose và sorbitol đều là nguồn carbon tốt cho sự tổng hợp protease ở vi khuẩn này (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002).
Khi nghiên cứu ảnh hƣởng của nguồn carbon lên khả năng sinh protease của
B. subtilis bằng cách bổ sung các thành phần khác nhau nhƣ tinh bột hòa tan,
maltose, lactose, saccharose và dextrose với nồng độ 0,5% vào môi trƣờng cơ bản (thịt-peptone), đồng thời khảo sát trên mẫu đối chứng và tiến hành nuôi cấy thu enzyme thô, xác định hoạt tính enzyme; các tác giả Đỗ Thị Bích Thủy và Trần Thị Xô (2004) nhận thấy tinh bột hòa tan là nguồn carbon giúp B. subtilis sinh tổng hợp protease tốt nhất và cho rằng tinh bột trong môi trƣờng đã kích thích chủng này sinh amylase. Chính amylase này là chất cảm ứng sinh protease. Tuy nhiên, khi khảo sát ảnh hƣởng của nguồn carbon lên khả năng sinh protease của một chủng Bacillus sp., Mehrotra và cs (1999) lại công bố rằng tinh bột không có vai trò kích thích. Trong khi đó, lactose, saccharose, dextrose kìm hãm khả năng sinh protease của chủng vi khuẩn này.
Nguồn nitơ
Nguồn nitơ trong môi trƣờng nuôi cấy có thể là các chất hữu cơ (protein và các sản phẩm thuỷ phân của protein) hoặc các muối vô cơ chứa nitơ (amoni, nitrat).
Nguồn nitơ hữu cơ thƣờng thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp protease của B. subtilis vì chúng có vai trò nhƣ chất cảm ứng của quá trình này. Các nguồn nitơ hữu cơ thƣờng dùng là: pepton, casein, albumin, bột đậu tƣơng... Trong số đó, peptone ở nồng độ thấp thƣờng là chất cảm ứng tốt nhất cho quá trình sinh tổng hợp protease. Thay thế peptone bằng casein sẽ làm giảm rõ rệt lƣợng protease đƣợc tổng hợp nhất là khi casein ở nồng độ cao.
Nguồn nitơ vô cơ tốt nhất cho vi khuẩn thƣờng là (NH4)2SO4. Các muối clorua, sulphate, nitrate amon thƣờng có ảnh hƣởng không tốt đến quá trình sinh tổng hợp protease.
Đối với B. subtilis việc sử dụng phối hợp nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ sẽ làm tăng đáng kể quá trình tổng hợp protease của chúng (Trần Ngọc Hùng, 2010)
Các nguyên tố khoáng đa lượng và vi lượng
Các hợp chất khoáng có ý nghĩa rất lớn trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật nói chung và B. subtilis nói riêng vì chúng làm thay đổi trạng thái hoá keo của tế bào
chất. Trong đó, phospho và lƣu huỳnh có ảnh hƣởng đáng kể đến quá trình sinh tổng hợp protease. Các photphate vô cơ có ảnh hƣởng không tốt đến sự sinh tổng hợp protease. Tuy nhiên, KH2PO4 thƣờng thúc đẩy đến quá trình sinh tổng hợp protease do tính chất đệm của nó. Lƣu huỳnh có ảnh hƣởng khác nhau, giữ vai trò điều hòa quá trình tổng hợp protease của vi sinh vật (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
Các vi sinh vật có thể lấy một số các chất khoáng khác nhƣ magiê, natri, sắt… thông qua một số dạng muối khoáng đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy hoặc có sẵn trong nguyên liệu pha môi trƣờng.
Cơ chất cảm ứng sinh tổng hợp protease
Trong số các enzyme do vi sinh vật tổng hợp, một số enzyme đƣợc tổng hợp với một lƣợng rất ít trong điều kiện thƣờng, nhƣng hàm lƣợng của chúng có thể tăng gấp nhiều lần khi chúng ta cho thêm một số hợp chất nhất định vào môi trƣờng nuôi cấy. Các enzyme này đƣợc gọi là các enzyme cảm ứng. Chất gây nên hiệu ứng này là chất cảm ứng. Nhƣ vậy có thể xem chất cảm ứng là cơ chất đặc hiệu của enzyme hay những chất tƣơng tự nhƣ cơ chất hoặc những sản phẩm trung gian của quá trình biến đổi các chất (Mayday và cs, 1986).
Khả năng sinh tổng hợp protease của B. subtilis thƣờng đƣợc cảm ứng bởi các chất giàu đạm nhƣ bột đậu nành, đậu phộng, bột cá, bột tôm, bột nghiền móng, sừng hoặc lông vũ... Tuy nhiên, đối với các loại cơ chất khác nhau thì hoạt độ enzyme cũng thể hiện không giống nhau. Do đó, trong môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật có
thể lựa chọn bổ sung các cơ chất thích hợp nhằm thu lƣợng lớn protease cần thiết một cách nhanh chóng và khoa học (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004)