chiếu xạ
Huyền dịch tế bào sau nuôi cấy thứ cấp khoảng 4h đƣợc xử lý chiếu xạ dải liều 0-3000 Gy. Pha loãng dịch nuôi sau chiếu xạ tới nồng độ thích hợp và cấy trải trên đĩa petri chứa môi trƣờng NA sao cho mỗi đĩa chứa khoảng 50-200 khuẩn lạc riêng rẽ, ủ đĩa ở 37oC trong 24 giờ.
Các khuẩn lạc đơn sẽ đƣợc lựa chọn ngẫu nhiên (50 khuẩn lạc cho mỗi liều chiếu) để nuôi riêng rẽ trên môi trƣờng NB và kiểm tra khả năng sinh protease bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch-casein. So sánh đƣờng kính vòng phân giải, những khuẩn lạc sinh protease có kích thƣớc vòng phân giải casein lớn hơn 10% so với chủng thuần đƣợc xem là các đột biến sinh protease cao. Tần số đột biến sinh protease cao ở mỗi liều chiếu xạ đƣợc tính theo công thức:
2.2.6. Sàng lọc các đột biến sinh protease cao từ Bacillus subtilis bằng xử lý chiếu xạ kết hợp với kháng sinh
Sau khi chiếu xạ ở các liều khác nhau trong dải liều 0-3000 Gy, huyền dịch tế bào B. subtilis ngay lập tức đƣợc trải lên môi trƣờng NA có bổ sung rifampicin và streptomycin (đối chứng dƣơng của lô thí nghiệm là dịch nuôi cấy sau chiếu xạ đƣợc trải lên môi trƣờng NA không kháng sinh). Quan sát và thống kê số lƣợng khuẩn lạc mọc lên từ sau 1-3 ngày, đây là những khuẩn lạc vừa kháng xạ vừa kháng kháng sinh. Tần số đột biến kháng rifampicin ở mỗi liều chiếu xạ là tỷ số giữa số lƣợng khuẩn lạc B. subtilis sống sót trên môi trƣờng bổ sung KS và và số khuẩn lạc ở lô đối chứng dƣơng.
Các khuẩn lạc đơn kháng xạ và kháng kháng sinh sẽ đƣợc lựa chọn để nuôi riêng rẽ trên môi trƣờng NB và kiểm tra khả năng sinh protease bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch-casein. Những khuẩn lạc sinh protease với kích thƣớc vòng phân giải casein lớn hơn 10% so với chủng thuần đƣợc xem là các đột biến sinh protease cao tiềm năng.