Trong tự nhiên, tỉ lệ đột biến phụ thuộc vào điều kiện phát triển của vi sinh vật và nằm trong khoảng từ 10-10
đến 10-6. Tỉ lệ này có thể tăng một cách rõ rệt bằng cách sử dụng các tác nhân gây đột biến thực nghiệm và thực tế có thể lên đến 10-5
đến 10-1 (Davati và cs, 2013). Có hai loại đột biến thực nghiệm là đột biến ngẫu nhiên và đột biến định hƣớng. Đột biến ngẫu nhiên thƣờng đƣợc tạo ra bằng các phƣơng pháp vật lý và hóa học (Malik, 1997). Các tác nhân vật lý nhƣ: các tia X, tia , α, β, neutron có bƣớc sóng ngắn nên có khả năng ion hóa và khả năng xuyên sâu cao. Các tia phóng xạ có thể gây đột biến bằng cách làm đứt gãy DNA, thay đổi cấu trúc của DNA hoặc hình thành các hợp chất có hoạt tính không ổn định làm biến đổi DNA. Bức xạ ion hóa có thể tạo ra đột biến tại những vị trí xác định nhằm cải thiện hoạt tính của vi sinh vật (Awan, 2011).
Các vi sinh vật nói chung có khả năng kháng với các đột biến cao hơn so với động vật và thực vật. Điều này có thể đƣợc giải thích bởi kích thƣớc cùng nhân tế bào nhỏ bé của vi sinh vật khó bị tác động bởi quá trình chiếu xạ. Các đột biến ở vi sinh vật thƣờng phức tạp hơn các sinh vật khác. Hơn thế, vi sinh vật có khả năng tự bảo vệ và sửa chữa phân tử DNA khi bị chiếu xạ. Phân tử DNA của vi sinh vật đƣợc bảo vệ nhờ quá trình hình thành bào tử và khả năng sử dụng các chất „bắt” gốc tự do nhƣ catalase, superoxide dismutase, và carotenoid (Hoe và cs, 2016). Một số loài hình thành bào tử nhƣ Bacillus sp. và Clostridium sp. là các vi khuẩn kháng xạ. Tuy nhiên, khi có đầy đủ chất dinh dƣỡng, bào tử nảy mầm sẽ tạo ra các tế bào sinh dƣỡng nhạy cảm hơn nhiều với bức xạ (Narumi, 2006). Prokaryote và sinh vật nhân chuẩn (nấm mốc và nấm men) đều có thể sửa chữa nhiều loại đứt gẫy trên phân tử DNA. Ngoài ra, điều kiện môi trƣờng trong quá
trình chiếu xạ bao gồm nhiệt độ, hàm lƣợng nƣớc, môi trƣờng nuôi cấy và oxy đều có thể ảnh hƣởng đến khả năng kháng xạ của vi sinh vật. Tăng nhiệt độ (trên 45°C) cũng làm tăng hiệu quả của xử lý chiếu xạ tới các tế bào sinh dƣỡng. Ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ môi trƣờng xung quanh, các vi sinh vật sinh dƣỡng kháng bức xạ mạnh hơn. Sự hiện diện của oxy cũng tăng tác động gây chết của bức xạ với vi sinh vật. Ngoài ra, tăng hàm lƣợng nƣớc cũng làm tăng ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ lên vi sinh vật do sự gia tăng quá trình hình thành các gốc tự do từ các phân tử nƣớc gây ra bởi bức xạ. Hơn nữa, khác thành phần của môi trƣờng xung quanh các vi sinh cũng gây ra các hiệu ứng khác nhau của chiếu xạ (Aquino, 2012). Do đó, việc áp dụng chiếu xạ gamma để gây đột biến ở vi sinh vật là không đơn giản.
Trong những năm gần đây, nghiên cứu sử dụng bức xạ γ làm tác nhân gây đột đột biến làm tăng khả năng sinh các sản phẩm thứ cấp ở nhiều loại vi sinh vật nhƣ
Trichoderma (Shahbazi và cs, 2014), Streptomyces (Moussa và cs, 2003), Aspergillus niger (Awan và cs, 2011), Bacillus (Yoon và cs, 1999; Jong và cs, 2010; GuiJun và cs,
2011; Afsharmaesh & cs, 2014)… đƣợc nhiều tác giả quan tâm.
Chủng Bacillus sp. là một trong số các vi sinh vật đƣợc sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu gây tạo đột biến bằng chiếu xạ gamma do chúng là các vi sinh vật sinh bào tử. Hơn thế, vi khuẩn này an toàn với những thông tin cơ bản sẵn có nhờ thế các nghiên cứu đột biến ở chúng sẽ dễ dàng và thuận lợi hơn. Có thể kể tới một số nghiên cứu tiêu biểu nhƣ:
Năm 1999, Yoon ki-Hong và nhóm của mình đã chiếu xạ chủng Bacillus sp. 79- 23 bằng bức xạ gamma trên nguồn Co-60 với dải liều từ 0,5 đến 5 kGy. Bằng cách ghi nhận vòng phân giải hình thành xung quanh mỗi khuẩn lạc đƣợc cấy trên thạch đĩa LB có 4% carboxymethylcellulose, 7 chủng đột biến có khả năng sinh CMCase đã đƣợc lựa chọn sau chiếu xạ. Hoạt tính enzyme CMCase của những chủng đột biến thu đƣợc thƣờng cao hơn chủng thuần từ 1,5 đến 2 lần (Yoon và cs, 1999).
Năm 2010, nhóm tác giả tại Viện Năng lƣợng Nguyên tử Malaysia đã tiến hành thí nghiệm xử lý chiếu xạ bằng nguồn Cobalt-60 chủng Bacillus sp. NMBCC 10023 phân lập từ đất. Dịch vi khuẩn sau chiếu xạ ở dải liều từ 1kGy đến 40kGy đƣợc nuôi cấy qua đêm trên môi trƣờng đĩa thạch NA. Kết quả cho thấy, liều chiếu trên 10 kGy có khả năng tiêu diệt hoàn toàn vi khuẩn. Ở liều chiếu dƣới 10 kGy, số lƣợng vi khuẩn sống sót giảm khi liều chiếu tăng. Liều D10 (gây chết 90%) của chủng Bacillus sp. NMBCC 10023 nằm từ 2-4 kGy và
khoảng liều này đƣợc lựa chọn để gây đột biến ở Bacillus sp. NMBCC 10023 (Jong và cs, 2010).
Nghiên cứu của GuiJun đã sử dụng bức xạ γ với liều chiếu từ 100 đến 2000 Gy trên Bacillus subtilis NCD-2, kết quả chỉ ra tỉ lệ chết tăng theo liều chiếu. Với liều 1000Gy tỉ lệ chết lên đến 99,5%. Tần số đột biến tăng dần trong khoảng liều từ 100 Gy đến 500 Gy và giảm dần từ 500 Gy trở đi. Liều chiếu từ 400 Gy đến 700 Gy cho tần suất đột biến cao (trung bình trên 15%) và tần suất cao nhất đạt 26,51% tại liều 500 Gy (GuiJun và cs, 2011).
Trong nghiên cứu của mình, Afsharmaesh và cộng sự đã sử dụng bức xạ gamma dải liều 100 – 3000 Gy gây đột biến làm tăng khả năng sinh hợp chất lipopeptide dùng phân hủy độc tố aflatoxin do nấm Aspergillus flavus tạo ra.
Sau khi đánh giá khả năng khử aflatoxin của 500 khuẩn lạc sau chiếu xạ, nhóm nghiên cứu đã chọn lọc đƣợc 6 chủng đột biến có hoạt tính cao hơn chủng tự nhiên (Afsharmaesh & cs, 2014).
Rõ ràng, xử lý chiếu xạ có thể dẫn đến những thay đổi về hình thái cũng nhƣ quá trình chuyển hóa ở vi sinh vật. Những thay đổi do chiếu xạ tạo ra là các thay đổi ngẫu nhiên có thể di truyền đƣợc và sự ổn định của chúng phụ thuộc vào sự tổn thƣơng ở mức độ phân tử của tế bào sau khi chiếu xạ cũng nhƣ khả năng kháng xạ của vi sinh vật. Loại bức xạ, khoảng cách của nguồn bức xạ, thời gian chiếu xạ…cũng là các yếu tố ảnh hƣởng tới sự ổn định của các đột biến vi sinh vật (Hoe & cs, 2016)
Nhƣ vậy, để tạo ra các đột biến vi sinh vật bằng bức xạ gamma, các phƣơng pháp với liều lƣợng bức xạ và điều kiện chiếu xạ khác nhau đã đƣợc công bố. Tuy nhiên, không có bất kỳ một khuyến cáo chung nào về khoảng liều tối ƣu để đạt đƣợc tỷ lệ đột biến cao do ảnh hƣởng của bức xạ tới mỗi loài hay chủng vi sinh vật là không giống nhau. Việc xây dựng đƣờng cong sống sót phụ thuộc liều, cũng nhƣ tổng hợp các nghiên cứu có liên quan để có đƣợc thông tin về hiệu quả của liều xử lý, điều kiện chiếu xạ, … là cần thiết để xác định khoảng liều phù hợp cho các đột biến mong muốn.
PHẦN II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ
2.1.1. Nguyên vật liệu
Các chủng B. subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào đƣợc thu thập từ các phòng thí nghiệm trong nƣớc nhƣ liệt kê trong Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào
ST T
Tên chủng Nguồn gốc Kí
hiệu
1 Bacillus subtilis B5 Viện Công nghệ Sinh học và Công nghiệp Thực phẩm - ĐH Bách Khoa
B5
2 B. subtilis H12 H12
3 B. subtilis NH Công ty TNHH Kyotobiken Hà Nội NH 4 B. subtilis VI Viện Vi sinh và Công nghệ Sinh học -
ĐH Quốc gia Hà Nội
VI 5 B. subtilis PN Phòng NC Công nghệ Bức xạ - TTCX
Hà Nội
PN
6 B. subtilis TN Bộ môn Vi sinh- Trƣờng ĐH Khoa học Tự nhiên- ĐH Quốc gia Hà Nội
TN
7 B. subtilis 002
Viện Vi sinh và Công nghệ Sinh học - ĐH Quốc gia Hà Nội
002
8 B. subtilis 131 131
9 B. subtilis 129 129
Chủng TB khả biến Escherichia coli DH5α, JM109 (Promega) dùng trong
quá trình biến nạp vector tái tổ hợp.
2.1.2. Hóa chất
Hóa chất và MT nuôi cấy vi sinh vật:
- Hóa chất: Pepton (Sigma), trypton (Sigma), cao nấm men (Merck), cao thịt (Sigma);
- Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật: NB (Nutrient Broth), NA (Nutrient Agar) do hãng Diffco cung cấp, LB (Luria Bertani) gồm: 1% trypton; 0,5% cao nấm men; 0,5% NaCl.
Hóa chất dùng cho định tính và định lƣợng protease: casein (Sigma), acetic acid (Merck), amido đen (Sigma), agar (Hạ Long), thuốc thử Folin, Na2HPO4, KH2PO4, NaOH, HCl, TCA (tricloro acid) … đều đảm bảo độ sạch phân tích.
Kit tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn: WizardSV Genomic DNA Purification System (Promega, Code A260).
Kit tách chiết DNA plasmid: Qiagen Plasmid Mini Kit (50) (Qiagen, Code 12125).
Kit tinh sạch sản phẩm PCR: High Pure PCR Product Purification Kit (Roche, Code 11732668001).
Kit tách dòng sản phẩm PCR: InsTAclone PCR Cloning Kit (Fermentas, Code K1214).
Các hóa chất dùng cho PCR: Jump Taq DNA polymerase (Sigma), dNTPs (Promega), MgCl2 25 mM (Promega).
Các hóa chất dùng cho điện di: acrylamide (USB), bisacrylamide (USB), agarose (Takara), TEMED (Thermo Scientific™), APS (Thermo Scientific™), ethidium bromide (Promega), thang chuẩn DNA 1 kb (Fermentas), thang chuẩn DNA 100 bp (Fermentas).
Các mồi khuếch đại đoạn gen rpoB và rpsL, các mồi dùng để sàng lọc vector tái tổ hợp, các mồi dùng trong đọc trình tự đƣợc cung cấp bởi hãng IDT (Mỹ).
2.1.3. Thiết bị
Nguồn Co-60 - Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội.
Các máy móc, thiết bị phục vụ cho thực hiện các nội dung nghiên cứu thuộc Phòng Nghiên cứu Công nghệ bức xạ, Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội (Viện Năng lƣợng Nguyên tử Việt nam), Phòng Thí nghiệm Sinh Y và Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Khoa Sinh học (Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội).
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Bảo quản và giữ giống 2.2.1. Bảo quản và giữ giống
Chủng giống B. subtilis (chủng thuần và chủng ứng viên mang đột biến có
ống thạch nghiêng chứa môi trƣờng NA. Sau khi cấy trên ống thạch,vi khuẩn đƣợc nuôi trong tủ ấm 37 oC qua đêm và bảo quản tối đa 30 ngày ở 4 oC trƣớc khi cấy truyền đợt tiếp theo.
Chủng giống E. coli DH5α khả biến và chủng tái tổ hợp mang vector có đoạn gen rpoB và rpsL đƣợc bảo quản ở -80 oC đƣợc cấy truyền trên đĩa thạch LB nuôi trong tủ ấm 37 o
C qua đêm. Môi trƣờng cho chủng khả biến không bổ sung kháng sinh ampicilin (50 ug/ml), đối với chủng tái tổ hợp có bổ sung ampicilin. Khuẩn lạc mọc riêng rẽ trên LB thạch đƣợc cấy trong LB lỏng để chuẩn bị tế bào khả biến hoặc để tách plasmid.
2.2.2. Xử lý chiếu xạ
2.2.2.1. Nuôi cấy huyền dịch tế bào
- Dùng que cấy vô trùng chuyển các khuẩn lạc riêng rẽ của chủng B. subtilis
thuần vào các bình tam giác chứa môi trƣờng NB, nuôi cấy lắc 120 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ 37 oC để thu đƣợc huyền dịch tế bào sơ cấp.
- Chuyển 100 µl huyền dịch tế bào dịch sơ cấp sang các bình tam giác chứa môi trƣờng NB (tỷ lệ 1/100) và tiếp tục nuôi cấy lắc 4-6 giờ ở 37 oC. Mật độ tế bào vi khuẩn trong huyền dịch đƣợc xác định thông qua giá trị OD. Khi quá trình sinh trƣởng của B. subtilis đạt tới pha Log (OD550 = 0,6-0,7), tiến hành thu huyền dịch tế bào thứ cấp.
- Huyền dịch tế bào thứ cấp đƣợc chuyển sang các ống nghiệm vô trùng (10 ml huyền dịch/ống). Các ống này đƣợc dán nhãn (ghi liều dự kiến) và đƣợc xử lý chiếu xạ trên thiết bị gamma Co-60 tại Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội.
2.2.2.2. Chiếu xạ dung dịch nuôi cấy:
Các ống nghiệm có chứa tế bào vi khuẩn ở pha Log đƣợc đem xử lý chiếu xạ trên nguồn gamma Co-60 ở dải liều 0-3 kGy (3 ống nghiệm lặp lại cho mỗi liều).
2.2.3. Xác định số lƣợng tế bào vi sinh vật
Số lƣợng tế bào B. subtilis trƣớc và sau xử lý chiếu xạ đƣợc xác định thông qua đếm số lƣợng khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng NA.
Dịch nuôi cấy vi khuẩn (trƣớc và sau chiếu xạ) đƣợc pha loãng theo dãy thập phân. 0,1 ml mẫu ở các độ pha loãng thích hợp đƣợc cấy vào đĩa petri chứa môi trƣờng NA (3 đĩa petri/độ pha loãng). Sử dụng que gạt vô trùng dàn đều các tế bào vi khuẩn trên bề mặt thạch. Số khuẩn lạc đƣợc đếm sau 24 giờ nuôi cấy ở 37 o
C và từ đó tính ra số lƣợng tế bào trong 1ml mẫu theo công thức:
Mi (CFU/ml) = Ai x Di/V
Trong đó : Ai là số khuẩn lạc trung bình/ đĩa ; Di là độ pha loãng và V là thể tích dịch huyền phù tế bào cấy vào mỗi đĩa (ml)
2.2.4. Định tính và định lƣợng protease
2.2.4.1. Phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch
Hoạt tính protease do các chủng B. subtilis sinh ra đƣợc xác định định tính bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch có chứa cơ chất là casein.
Chuẩn bị dung dịch Sorencen
- Pha Na2HPO4 1/15 M: 5,96 g Na2HPO4 trong 250 ml H20 - Pha K2HPO4 1/15 M: 0,9072 g KH2PO4 trong 100 ml H20
- Pha dung dịch Sorencen 1/15 M pH 7,6: 177 ml Na2HPO4 và 23 ml KH2PO4 đã chuẩn bị, sau đó chuẩn lại pH 7,6.
Đổ đĩa casein 0,1%
- Bổ sung 0,1 g casein vào trong 100 ml dung dịch Sorencen pH 7,6
- Sau khi đun tan đều, tiến hành lọc dịch trong. Để nguội và bổ sung 1,5 g agar/100 ml dung dịch.
- Đun tan đều và đổ đĩa. Các đĩa có đƣờng kính đĩa bằng nhau đƣợc đổ cùng 1 thể tích (25 ml/1 đĩa 9, 70ml/1 đĩa 14) để đảm bảo độ dày của lớp thạch- casein là nhƣ nhau ở tất cả các đĩa thí nghiệm..
- Đĩa đƣợc để nguội và giữ trong tủ lạnh 4 oC, có thể dùng trong 1 tháng sau khi đổ nếu đƣợc bảo quản lạnh.
Chuẩn bị thuốc nhuộm amido đen 0,1%
- Tiến hành pha dung dịch acetic acid 10% làm dung môi cho thuốc nhuộm và dung dịch rửa sau khi nhuộm.
- Bổ sung 0,1g thuốc nhuộm amido đen vào 100 ml dung dịch acetic acid 10%, khuấy trên máy khuấy từ đến tan hết, lọc qua giấy lọc và bảo quản tránh ánh sáng (dung dịch sau khi rửa có thể sử dụng lại nhƣng nhất thiết phải tránh ánh sáng).
- Các chủng B. subtilis đƣợc nuôi cấy trong ống Eppendorf có chứa 700 µl môi trƣờng NB, lắc 120 vòng/ phút trong 24 giờ ở 37 o
C.
- Ly tâm tách tế bào ở 10.000 vòng/ phút, nhiệt độ 4 oC trong 10 phút để thu dịch enzyme.
- Nhỏ 30 µl dịch enzyme vào mỗi giếng đã chuẩn bị sẵn trên đĩa thạch 0,1% casein.
- Sau khi ủ ở 37 oC trong 17-24 giờ, các đĩa thạch-casein đƣợc nhuộm amido đen trong 30 phút, rửa nhuộm và quan sát vòng phân giải casein. Các chủng có vòng phân giải casein lớn là những chủng có khả năng sinh protease cao. Các bƣớc thử hoạt tính protease đƣợc thực hiện theo sơ đồ trên Hình 2.1
Hình 2.1. Sơ đồ các bƣớc thử hoạt tính protease 2.2.4.2. Phƣơng pháp Anson cải tiến
Nguyên tắc
Cho protease tác dụng với cơ chất casein, sản phẩm tạo thành là các peptit ngắn hay các amino acid. Trong các loại amino acid, tyrosin chiếm đa số. Xác định tyrosin bằng phản ứng màu với thuốc thử folin, từ đó xác định hoạt tính protease theo định nghĩa: hoạt tính protease đƣợc biểu thị là số micromol tyrosin sinh ra do thuỷ phân casein bởi 1ml dung dịch hay 1 mg hỗn hợp chứa protease trong 1 phút ở điều kiện chuẩn (35,5 oC, pH 7,6).
Pha hoá chất
- Dung dịch casein 1%: đun sôi cách thủy 1 g casein trong đệm sorence đến tan hoàn toàn rồi sau đó định mức bằng sorense cho đủ 100 ml.
- Dung dịch TCA (tricloro acid) 10%: hòa tan 10g TCA trong nƣớc cho đủ 100 ml.
- Dung dịch NaOH 0,5N: hòa tan 10 g NaOH trong nƣớc cho đủ 500 ml. Nhuộm amido đen 30 phút Dịch protease ngoại bào Nhỏ dịch lên đĩa casein 0,1% Ủ 37 o C, 17-24 h Chụp ảnh, phân