Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng High Pure PCR Product Purification Kit của hãng Roche. Quy trình đƣợc thực hiện theo đúng hƣớng dẫn của nhà sản xuất. 2.2.7.4. Phƣơng pháp điện di DNA
Điện di là phƣơng pháp phân tách các đoạn DNA có kích thƣớc và cấu hình khác nhau. Dƣới tác dụng của điện trƣờng trong đệm trung tính, các đoạn DNA tích điện âm sẽ di chuyển về cực dƣơng, đoạn kích thƣớc nhỏ hơn sẽ di chuyển nhanh hơn. Trong nghiên cứu sử dụng loại giá thể agarose ở nồng độ 1% (với DNA tổng số) và 1,5% (các sản phẩm PCR có kích thƣớc khoảng 500 bp). Cả 2 loại gel agarose đều đƣợc chạy trong đệm TBE 1X (với thành phần trong 100ml nhƣ sau: 1,08 g tris-base; 0,55 g boric acid; 400 µl EDTA 0,5 M pH 8). Sau khi kết thúc điện di, DNA đƣợc nhuộm với ethidium bromide và phát hiện dƣới tia UV của hệ thống máy chụp ảnh gel UVP (Mỹ).
2.2.7.5. Giải trình tự
Sản phẩm PCR đƣợc giải trình tự trên hệ thống máy đọc tự động do Công ty First One (Hàn Quốc) thực hiện.
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. TUYỂN CHỌN CHỦNG Bacillus subtilis CÓ KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CAO LÀM NGUYÊN LIỆU GÂY TẠO ĐỘT BIẾN PROTEASE CAO LÀM NGUYÊN LIỆU GÂY TẠO ĐỘT BIẾN
3.1.1. Tuyển chọn các chủng Bacillus subtilis có hoạt tính cao và ổn định
Chín chủng B. subtilis thuần có khả năng sinh protease đã thu thập, đƣợc nuôi
cấy riêng rẽ trên môi trƣờng NB trong 24 giờ. Hoạt tính protease của chúng đƣợc định tính trên đĩa thạch-casein và nhuộm bằng thuốc nhuộm amido đen, kết quả thu đƣợc trình bày trong Bảng 3.1 và Hình 3.1.
Bảng 3.1. Kích thƣớc vòng phân giải casein của 09 chủng B. subtilis có khả năng sinh protease
STT Tên chủng Kí hiệu Đƣờng (mm) kính 1 B5 1 18,5 ± 0,25 2 H12 2 18,5 ± 0,25 3 NH 3 - 4 VI 4 18,75 ± 0,5 5 TN 5 8 ± 0 6 PN 6 8 ± 0 7 002 7 - 8 131 8 15,25 ± 0,25 9 129 9 17,25 ± 0,25
Hình 3.1. Vòng phân giải casein của 09 chủng B. subtilis có khả năng sinh protease
*Thí nghiệm được lặp lại trên 3 đĩa và 2 lần trên cùng một đĩa casein cho mỗi
chủng;(-) không có vòng phân giải
Bƣớc đầu kiểm tra, 05 chủng có đƣờng kính phân giải casein lớn hơn các chủng còn lại đƣợc lựa chọn để tiếp tục tuyển chọn các chủng có hoạt tính vƣợt trội và ổn định. Đó là các chủng B5, H12, VI, 131 và 129.
Kiểm tra lại hoạt tính protease của 05 chủng nhận thấy các chủng B5, H12 và VI cho vòng phân giải casein lớn hơn và có tính ổn định giữa các lô thí nghiệm so với 02 chủng còn lại (Hình 3.2 và Bảng 3.2). Kết quả định lƣợng protease của 5
chủng bằng phƣơng pháp Anson cải tiến đƣợc trình bày trong Hình 3.3.
Bảng 3.2. Kích thƣớc vòng phân giải casein của 05 chủng có khả năng sinh protease ST T Tên chủng Kí hiệu Đƣờng kính (mm) 1 B5 1-1‟ 18,5 ± 0,25 2 H12 2-2‟ 18,5 ± 0 3 VI 4-4‟ 18,25± 0,5 4 131 8-8‟ - 5 129 9 16,75 129 9‟ -
Hình 3.2. Vòng phân giải casein của 05 chủng có khả năng sinh protease cao
*Thí nghiệm được lặp lại trên 3 đĩa và 2 lần trên cùng một đĩa casein cho mỗi chủng;(-) không có vòng phân giải.
Hình 3.3. Hoạt độ protease của các chủng B. subtilis tuyển chọn
Kết quả (Hình 3.2) cho thấy chủng 129 tƣơng ứng với ký hiệu số 9, 9,, trên đĩa thạch có khả năng sinh protease không ổn định giữa hai lần thí nghiệm còn 3 chủng khác là chủng B5, H12 và VI có khả năng sinh protease ổn định với đƣờng kính vòng thủy phân tƣơng đối đồng đều ở hai lần thí nghiệm lặp lại. Kết quả phân
IU/ml và sai khác không có ý nghĩa thống kê. Chủng VI có hoạt tính hơi thấp hợp một chút nhƣng khá ổn định. Do vậy, 3 chủng B. subtilis là B5, H12 và VI sẽ đƣợc sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng sinh protease của các chủng Bacillus subtilis chủng Bacillus subtilis
Các chủng Bacillus subtilis B5, H12 và VI thuần đƣợc nuôi cấy riêng rẽ trên môi trƣờng NB. Quá trình nuôi cấy lắc đƣợc thực hiện ở điều kiện 37 o
C, 120 vòng/phút, dịch nuôi cấy vi khuẩn đƣợc thu sau các thời điểm 2, 4, 6, 8, 12, 24 và 48 giờ. Hoạt tính protease trong dịch ngoại bào của các chủng vi khuẩn tại các thời điểm nuôi cấy khác nhau đƣợc định tính bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch-casein 0,1%. Kết quả đo kích thƣớc vòng phân giải casein đƣợc trình bày trong Hình 3.4.
Hình 3.4. Kích thƣớc vòng phân giải casein bởi protese của các chủng Bacillus subtilis tạo ra tại các thời điểm nuôi cấy khác nhau
Kết quả cho thấy hoạt tính protease do cả 3 chủng B. subtilis tạo ra tăng dần theo
thời gian nuôi cấy và đạt giá trị cao nhất vào thời điểm 8 giờ. Hoạt tính giảm không đáng kể và tƣơng đối ổn định từ 10-24 giờ, sau thời điểm này hoạt tính có xu hƣớng giảm nhẹ đến 48 giờ. Nhƣ vậy, hoạt độ protease lớn nhất tƣơng đối đồng nhất với giá trị OD550 cao nhất đo đƣợc của dịch nuôi cấy tại thời điểm 8 giờ tức là lúc mật độ tế bào lớn nhất (số liệu không đƣợc trình bày ở đây). Mặc dù vậy do hoạt tính enzym giảm không đáng kể và ổn định trong suốt khoảng thời gian từ 10-24 giờ, nên đây là thời điểm thuận lợi để thu dịch và kiểm tra hoạt tính protease.
A B
Hình 3.5. Hoạt tính protease của các chủng B. subtilis đƣợc kiểm tra ngay sau
khi thu (A) và sau bảo quản 48 giờ (B)
Trong đó, số 1, 2 và 3 là dịch ngoại bào thu sau 24h nuôi cấy, số 1’,2’ và 3’là dịch ngoại bào thu sau 48 giờ nuôi cấy
Bên cạnh việc kiểm tra hoạt tính protease tại các thời điểm khác nhau thì ảnh hƣởng của thời gian bảo quản tới hoạt tính dịch enzym ngoại bào cũng đƣợc đánh giá. Protease của dịch ngoại bào đƣợc thu tại hai thời điểm (24 và 48 giờ) ngay lập tức đƣợc xác định định định tính bằng phƣơng pháp khuếch tán hoặc bảo quản 4
o
C trong 48 giờ rồi mới đem kiểm tra. Kết quả thí nghiệm trong Hình 3.5-A cho thấy không có sự khác nhau đáng kể về hoạt tính protease của dịch ngoại bào thu tại thời điểm sau 24 và 48 giờ nuôi cấy. Tuy nhiên, thời gian bảo quản dịch ngoại bào
ảnh hƣởng đáng kể tới hoạt tính protease của các chủng, hoạt tính bị giảm rõ rệt sau khi dịch đƣợc bảo quản lạnh 4 oC, 48 giờ (Hình 3.5-B)
Nhƣ vậy, để thuận tiện và giảm thiểu mức độ suy giảm hoạt tính protease, thời gian nuôi cấy 24 giờ và kiểm tra hoạt tính enzyme ngay sau khi thu dịch nuôi sẽ đƣợc lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2. ẢNH HƢỞNG CỦA XỬ LÝ CHIẾU XẠ TỚI CHỦNG VK BACILLUS SUBTILIS VÀ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA CHÚNG SUBTILIS VÀ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA CHÚNG 3.2.1. Đánh giá quá trình sinh trƣởng của các chủng Bacillus subtilis
Với mục đích chọn đƣợc thời điểm mà sự sinh trƣởng thích hợp cho việc xử lý chiếu xạ, đƣờng cong sinh trƣởng của 3 chủng tiềm năng B. subtilis B5, H12 và VI đã đƣợc khảo sát.
Các chủng B. subtilis B5, H12 và VI đƣợc nuôi cấy lắc 120 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ 37 oC để thu đƣợc huyền dịch tế bào sơ cấp. Dịch sơ cấp đƣợc chuyển sang môi trƣờng NB (tỷ lệ 1/100) và tiếp tục nuôi cấy lắc ở 37 oC. Mật độ tế bào đƣợc xác định thông qua giá trị OD của dịch nuôi cấy vi khuẩn ở bƣớc sóng 550 nm tại các thời điểm 0, 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16 và 24 giờ. Đƣờng cong sinh trƣởng của 3 chủng B. subtilis đƣợc trình bày trong Hình 3.6
Hình 3.6. Đƣờng cong sinh trƣởng của các chủng Bacillus subtilis tiềm năng (♦ - B5, ■ - H12 và ▲ – VI)
Dựa vào đồ thị Hình 3.6 cùng kết quả số liệu đo OD, chúng tôi nhận thấy giai đoạn pha Log của 3 chủng vi khuẩn là từ 2-6 giờ. Thời điểm 8 h giá trị OD đạt cao nhất và ổn định tới 14 h sau nuôi cấy. Tại các thời điểm dài hơn, độ đục của dịch nuôi cấy giảm, giá trị OD là 0,71, 0,48 và 0,45 tƣơng ứng với các chủng B5, H12 và VI sau 24 giờ nuôi cấy (số liệu không thể hiện trên hình). Điều này có thể đƣợc giải thích bởi các tế bào kết lại với nhau thành đám có thể quan sát rõ bằng mắt thƣờng, dịch nuôi cấy trong hơn do vậy giá trị đo OD cũng giảm theo.
Nhƣ vậy, đối với xử lý chiếu xạ dịch nuôi cấy: sau khoảng 4 giờ nuôi cấy thứ cấp khi quá trình sinh trƣởng của các chủng B. subtilis ở pha Log (OD550= 0,6-0,7), dịch nuôi sẽ đƣợc đem xử lý chiếu xạ các liều khác nhau trên nguồn gamma Co-60.
3.2.2. Ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng sống sót của các chủng
Bacillus subtilis
+ Xử lý chiếu xạ dịch nuôi cấy Bacillus subtilis
Tác động của bức xạ gamma tới khả năng sống sót của 03 chủng B. subtilis
đƣợc đánh giá định tính bằng phƣơng pháp nhỏ trực tiếp 5 µl dịch nuôi cấy thứ cấp đã xử lý chiếu xạ liều khác nhau lên cùng một đĩa petri chứa môi trƣờng NA, đĩa đƣợc nuôi cấy ở 37 o
C và quan sát sau 24 giờ. Kết quả cho thấy với cùng một thể tích huyền dịch tế bào đƣợc nuôi cấy có sự khác biệt rõ rệt về mật độ quần thể giữa các mẫu vi khuẩn đƣợc chiếu xạ và không chiếu xạ nhƣ đƣợc chỉ ra trong Hình 3.7- A. Số lƣợng khuẩn lạc dƣờng nhƣ phụ thuộc vào liều bức xạ. Chúng nhanh chóng giảm ở các mẫu đƣợc chiếu xạ ở liều cao hơn 700 Gy và chỉ có thể thấy một vài khuẩn lạc đối với mẫu đƣợc chiếu xạ ở 3000 Gy.
Tác động của bức xạ gamma tại các liều chiếu khác nhau tới các chủng B. subtilis còn đƣợc xác định thông qua việc đếm số khuẩn lạc B. subtilis ở cả dịch
nuôi cấy xử lý chiếu xạ và không chiếu xạ. Rõ ràng khả năng sống sót của vi khuẩn bị ảnh hƣởng đáng kể bởi bức xạ gamma, tỷ lệ tế bào sống sót ở cả 3 chủng vi khuẩn đều giảm khi tăng liều bức xạ. Tác động của bức xạ đối với cả 3 chủng B.
subtilis đƣợc biểu diễn nhƣ hàm logarit của các tế bào sống sót (CFU/ml) với liều
A B
Hình 3.7. Mối tƣơng quan giữa số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis sống sót trong dịch nuôi cấy và liều chiếu xạ
Kết quả cũng cho thấy đƣờng cong sống sót của B. subtilis phụ thuộc liều
chiếu xạ dƣờng nhƣ là đƣờng cong dạng hai pha “bimodal” với độ nhạy cảm phóng xạ giảm dần của các tế bào ở liều xử lý cao hơn 1500 Gy. Sự kết hợp của vi khuẩn
để hình thành các cụm tế bào lớn hơn trong quá trình chiếu xạ có thể đã làm tăng khả năng kháng xạ của B. subtilis ở các liều xử lý cao hơn này (Yazdi và Ardekani, 2012).
Nghiên cứu khả năng sống sót của bào tử Bacillus sp. bởi bức xạ gamma, Yoon Ki-Hong và cs nhận thấy tỷ lệ sống sót của bào tử Bacillus sp. 79-23 chiếu xạ giảm theo cấp số nhân trong dải liều dao động từ 0,5 đến 5 kGy. Ở 3 và 5 kGy số lƣợng TB còn lại tƣơng ứng xấp xỉ 5% và 1% (Yoon và cs, 1999). Trong một nghiên cứu khác, Bacillus sp. NMBCC 10023 ban đầu đƣợc phân lập từ đất đã đƣợc chiếu xạ với liều 1-40 kGy trên nguồn Co-60. Kết quả là tỷ lệ sống sót của vi khuẩn giảm tuyến tính khi liều chiếu xạ tăng tới 10 kGy. Liều chiếu trên 10 kGy có khả năng tiêu diệt hoàn toàn vi khuẩn và giá trị D10 của chủng Bacillus sp. NMBCC 10023 này nằm trong khoảng 2-4 kGy (Jong và cs, 2010). Gui Jun và cs báo cáo rằng tỷ lệ chết của B. subtilis NCD-2 tăng theo liều chiếu xạ gamma trong khoảng 100 đến 2000 Gy và ở liều 1000 Gy tỉ lệ chết lên đến 99,5% (GuiJun và cs, 2011). Xử lý chiếu xạ tia gamma chủng B. subtilis UTB1 ở dải liều 100 – 3000 Gy Afsharmaesh & cs cũng nhận thấy tỷ lệ sống sót của chủng UTB1 tỷ lệ nghịch với liều chiếu xạ và mối tƣơng quan giữa số lƣợng vi khuẩn sống sót (Log Scale) và liều xử lý dƣờng nhƣ theo một mô hình khá tuyến tính (linear model) (Afsharmaesh và cs, 2014).
Những khác biệt này có thể giải thích khi cho rằng các yếu tố nhƣ nhiệt độ, giai đoạn sinh trƣởng, bản chất của môi trƣờng dạng khí, thành phần hóa học của môi trƣờng nuôi cấy… cũng nhƣ điều kiện sinh lý và khả năng tự chữa sửa của tế bào đã ảnh hƣởng đến sự tồn tại của chúng sau chiếu xạ.
3.2.3. Ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng sinh protease của các chủng
Bacillus subtilis
Chiếu xạ là quá trình truyền năng lƣợng điển hình của bức xạ cho đối tƣợng bị chiếu xạ. Khi chiếu xạ các chủng vi khuẩn ở dạng dung dịch nuôi cấy, cơ chế tác động gián tiếp của bức xạ ion sẽ chiếm ƣu thế so với tác động trực tiếp. Mặt khác, tăng hàm lƣợng nƣớc cũng làm tăng ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ lên vi sinh vật do sự gia tăng quá trình hình thành các gốc tự do từ các phân tử nƣớc gây ra bởi bức xạ. Vì vậy, chiếu xạ vi khuẩn trong dung dịch nuôi cấy có thể gây ra những tổn
giả thuyết này, phƣơng án chiếu xạ dung dịch nuôi cấy vi khuẩn sẽ đƣợc lựa chọn để sàng lọc các chủng B. subtilis kháng xạ có khả năng sinh protease cao.
Các khuẩn lạc đơn kháng xạ sẽ đƣợc lựa chọn ngẫu nhiên (50 khuẩn lạc cho mỗi liều chiếu) để nuôi riêng rẽ trên môi trƣờng NB và kiểm tra khả năng sinh protease bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch-casein. Những khuẩn lạc có kích thƣớc vòng phân giải casein lớn hơn 10% so với chủng thuần đƣợc xem là các đột biến sinh protease cao. Tỷ lệ đột biến sinh protease cao ở các chủng B. subtilis tại mỗi liều chiếu xạ đƣợc trình bày trong Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Tỷ lệ đột biến sinh protease cao của 3 chủng B. subtilis tại các liều chiếu xạ khác nhau
Liều chiếu (Gy)
Tỷ lệ đột biến (%) sinh protease cao
B. subtilis B5 B. subtilis H12 B. subtilis VI
100 5,00±0,50 6,00±0,00 4,33±0,28 300 7,33±0,67 7,67±0,39 5,67±0,28 500 8,00±0,37 8,33±0,56 7,67±0,28 700 13,00±0,67 12,33±0,56 15,33±0,44 1000 14,33±0,72 17,00 ±0,67 16,00±0,33 1500 12,67±0,37 16,33±0,78 15,67±0,56 2000 7,33±0,44 9,00±0,50 10,33±0,28 3000 5,33±0,28 7,00±0,50 8,67±0,44
Tỷ lệ đột biến thƣờng liên quan tới liều chiếu xạ (Hoe và cs, 2016). Kết quả cho thấy đột biến sinh protease cao xuất hiện ở tất cả các liều xạ, tỷ lệ đột biến dƣờng nhƣ cao hơn trong khoảng liều từ 700-1500 kGy so với các liều khảo sát còn lại và kết quả lặp lại ở cả 3 chủng B. subtilis B5, H12 và VI. Nhƣ vậy, dựa vào đƣờng cong sống sót phụ thuộc liều chiếu xạ của 3 chủng vi khuẩn này (Hình 3.7) nhận thấy đột biến sinh protease lớn hơn chủng thuần thu đƣợc nhiều hơn khi số lƣợng tế bào sống sau chiếu xạ giảm từ 1000 đến 10 000 lần (3-4 đơn vị Log) so với dạng thuần không chiếu xạ.
Kết quả thu đƣợc phù hợp với nghiên cứu của Afsharmaesh & cs khi sử dụng bức xạ gamma làm tác nhân gây đột biến ngẫu nhiên với chủng B. subtilis UTB1 để làm tăng khả năng sinh hợp chất lipopeptide dùng phân hủy độc tố aflatoxin của nấm Aspergillus flavus. Tỷ lệ đột biến mong muốn cao nhất ở chủng này đạt đƣợc tại liều 2-3 kGy, cũng là liều làm số lƣợng tế bào sống giảm từ 3-4 đơn vị Log so với mẫu đối chứng không chiếu xạ (Afsharmaesh và cs, 2014).
Trong một nghiên cứu khác Yoon Ki-Hong chiếu xạ chủng Bacillus sp. 79-23 bằng bức xạ gamma trên nguồn Co-60, dải liều từ 3000- 5000 Gy đƣợc lựa chọn để sàng các chủng đột biến kháng xạ có khả năng sinh CMCase cao hơn 1,5-2 lần so với chủng thuần. Tại khoảng liều này các tác giả nhận thấy số lƣợng tế bào sống sót sau chiếu xạ xấp xỉ 1-5% (Yoon và cs, 1999). Đối với 3 chủng B. subtilis trong
nghiên cứu này số lƣợng tế bào sống sót sau chiếu xạ không quá 3% ở khoảng liều 700-1500 Gy.
Nghiên cứu của GuiJun đã sử dụng bức xạ gamma với liều chiếu từ 100 đến 2000 Gy trên B. subtilis NCD-2 với mục đích tạo ra các thể đột biến có khả năng ức