2.2.1. Bảo quản và giữ giống
Chủng giống B. subtilis (chủng thuần và chủng ứng viên mang đột biến có
ống thạch nghiêng chứa môi trƣờng NA. Sau khi cấy trên ống thạch,vi khuẩn đƣợc nuôi trong tủ ấm 37 oC qua đêm và bảo quản tối đa 30 ngày ở 4 oC trƣớc khi cấy truyền đợt tiếp theo.
Chủng giống E. coli DH5α khả biến và chủng tái tổ hợp mang vector có đoạn gen rpoB và rpsL đƣợc bảo quản ở -80 oC đƣợc cấy truyền trên đĩa thạch LB nuôi trong tủ ấm 37 o
C qua đêm. Môi trƣờng cho chủng khả biến không bổ sung kháng sinh ampicilin (50 ug/ml), đối với chủng tái tổ hợp có bổ sung ampicilin. Khuẩn lạc mọc riêng rẽ trên LB thạch đƣợc cấy trong LB lỏng để chuẩn bị tế bào khả biến hoặc để tách plasmid.
2.2.2. Xử lý chiếu xạ
2.2.2.1. Nuôi cấy huyền dịch tế bào
- Dùng que cấy vô trùng chuyển các khuẩn lạc riêng rẽ của chủng B. subtilis
thuần vào các bình tam giác chứa môi trƣờng NB, nuôi cấy lắc 120 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ 37 oC để thu đƣợc huyền dịch tế bào sơ cấp.
- Chuyển 100 µl huyền dịch tế bào dịch sơ cấp sang các bình tam giác chứa môi trƣờng NB (tỷ lệ 1/100) và tiếp tục nuôi cấy lắc 4-6 giờ ở 37 oC. Mật độ tế bào vi khuẩn trong huyền dịch đƣợc xác định thông qua giá trị OD. Khi quá trình sinh trƣởng của B. subtilis đạt tới pha Log (OD550 = 0,6-0,7), tiến hành thu huyền dịch tế bào thứ cấp.
- Huyền dịch tế bào thứ cấp đƣợc chuyển sang các ống nghiệm vô trùng (10 ml huyền dịch/ống). Các ống này đƣợc dán nhãn (ghi liều dự kiến) và đƣợc xử lý chiếu xạ trên thiết bị gamma Co-60 tại Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội.
2.2.2.2. Chiếu xạ dung dịch nuôi cấy:
Các ống nghiệm có chứa tế bào vi khuẩn ở pha Log đƣợc đem xử lý chiếu xạ trên nguồn gamma Co-60 ở dải liều 0-3 kGy (3 ống nghiệm lặp lại cho mỗi liều).
2.2.3. Xác định số lƣợng tế bào vi sinh vật
Số lƣợng tế bào B. subtilis trƣớc và sau xử lý chiếu xạ đƣợc xác định thông qua đếm số lƣợng khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng NA.
Dịch nuôi cấy vi khuẩn (trƣớc và sau chiếu xạ) đƣợc pha loãng theo dãy thập phân. 0,1 ml mẫu ở các độ pha loãng thích hợp đƣợc cấy vào đĩa petri chứa môi trƣờng NA (3 đĩa petri/độ pha loãng). Sử dụng que gạt vô trùng dàn đều các tế bào vi khuẩn trên bề mặt thạch. Số khuẩn lạc đƣợc đếm sau 24 giờ nuôi cấy ở 37 o
C và từ đó tính ra số lƣợng tế bào trong 1ml mẫu theo công thức:
Mi (CFU/ml) = Ai x Di/V
Trong đó : Ai là số khuẩn lạc trung bình/ đĩa ; Di là độ pha loãng và V là thể tích dịch huyền phù tế bào cấy vào mỗi đĩa (ml)
2.2.4. Định tính và định lƣợng protease
2.2.4.1. Phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch
Hoạt tính protease do các chủng B. subtilis sinh ra đƣợc xác định định tính bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch có chứa cơ chất là casein.
Chuẩn bị dung dịch Sorencen
- Pha Na2HPO4 1/15 M: 5,96 g Na2HPO4 trong 250 ml H20 - Pha K2HPO4 1/15 M: 0,9072 g KH2PO4 trong 100 ml H20
- Pha dung dịch Sorencen 1/15 M pH 7,6: 177 ml Na2HPO4 và 23 ml KH2PO4 đã chuẩn bị, sau đó chuẩn lại pH 7,6.
Đổ đĩa casein 0,1%
- Bổ sung 0,1 g casein vào trong 100 ml dung dịch Sorencen pH 7,6
- Sau khi đun tan đều, tiến hành lọc dịch trong. Để nguội và bổ sung 1,5 g agar/100 ml dung dịch.
- Đun tan đều và đổ đĩa. Các đĩa có đƣờng kính đĩa bằng nhau đƣợc đổ cùng 1 thể tích (25 ml/1 đĩa 9, 70ml/1 đĩa 14) để đảm bảo độ dày của lớp thạch- casein là nhƣ nhau ở tất cả các đĩa thí nghiệm..
- Đĩa đƣợc để nguội và giữ trong tủ lạnh 4 oC, có thể dùng trong 1 tháng sau khi đổ nếu đƣợc bảo quản lạnh.
Chuẩn bị thuốc nhuộm amido đen 0,1%
- Tiến hành pha dung dịch acetic acid 10% làm dung môi cho thuốc nhuộm và dung dịch rửa sau khi nhuộm.
- Bổ sung 0,1g thuốc nhuộm amido đen vào 100 ml dung dịch acetic acid 10%, khuấy trên máy khuấy từ đến tan hết, lọc qua giấy lọc và bảo quản tránh ánh sáng (dung dịch sau khi rửa có thể sử dụng lại nhƣng nhất thiết phải tránh ánh sáng).
- Các chủng B. subtilis đƣợc nuôi cấy trong ống Eppendorf có chứa 700 µl môi trƣờng NB, lắc 120 vòng/ phút trong 24 giờ ở 37 o
C.
- Ly tâm tách tế bào ở 10.000 vòng/ phút, nhiệt độ 4 oC trong 10 phút để thu dịch enzyme.
- Nhỏ 30 µl dịch enzyme vào mỗi giếng đã chuẩn bị sẵn trên đĩa thạch 0,1% casein.
- Sau khi ủ ở 37 oC trong 17-24 giờ, các đĩa thạch-casein đƣợc nhuộm amido đen trong 30 phút, rửa nhuộm và quan sát vòng phân giải casein. Các chủng có vòng phân giải casein lớn là những chủng có khả năng sinh protease cao. Các bƣớc thử hoạt tính protease đƣợc thực hiện theo sơ đồ trên Hình 2.1
Hình 2.1. Sơ đồ các bƣớc thử hoạt tính protease 2.2.4.2. Phƣơng pháp Anson cải tiến
Nguyên tắc
Cho protease tác dụng với cơ chất casein, sản phẩm tạo thành là các peptit ngắn hay các amino acid. Trong các loại amino acid, tyrosin chiếm đa số. Xác định tyrosin bằng phản ứng màu với thuốc thử folin, từ đó xác định hoạt tính protease theo định nghĩa: hoạt tính protease đƣợc biểu thị là số micromol tyrosin sinh ra do thuỷ phân casein bởi 1ml dung dịch hay 1 mg hỗn hợp chứa protease trong 1 phút ở điều kiện chuẩn (35,5 oC, pH 7,6).
Pha hoá chất
- Dung dịch casein 1%: đun sôi cách thủy 1 g casein trong đệm sorence đến tan hoàn toàn rồi sau đó định mức bằng sorense cho đủ 100 ml.
- Dung dịch TCA (tricloro acid) 10%: hòa tan 10g TCA trong nƣớc cho đủ 100 ml.
- Dung dịch NaOH 0,5N: hòa tan 10 g NaOH trong nƣớc cho đủ 500 ml. Nhuộm amido đen 30 phút Dịch protease ngoại bào Nhỏ dịch lên đĩa casein 0,1% Ủ 37 o C, 17-24 h Chụp ảnh, phân tích kết quả
- Dung dịch HCl 0,2N: trộn 4,25 ml HCl đậm đặc với nƣớc cho đủ100 ml. - Dung dịch tyrosin 20mM: khuấy nghiền 0,181 g tyrosin trong dung dịch HCl 0,2N cho vừa đủ 50 ml.
- Dung dịch tyrosin chuẩn 1mM: pha loãng 5 ml tyrosin 20mM trong HCl 0,2N thành 100 ml.
Đường chuẩn tyrosin
Bảng 2.2.Tỷ lệ các hóa chất cần pha cho xây dựng đƣờng chuẩn tyrosin
Dung dịch hóa chất Ống nghiệm
0 1 2 3 4 5
Dung dịch tyrosine chuẩn (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Dung dịch HCl 0,2N (ml) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 Thuốc thử folin (ml) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 Lƣợng tyrsosine (mM) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Sau khi pha các dung dịch, lắc đều và giữ nguyên 10 phút và đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 660 nm.
Ống số 0 là ống đối chứng, các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN). Vẽ đƣờng chuẩn tyrosin tƣơng quan giữa lƣợng tyrosin (µM) và ΔOD (ΔOD = ODTN – ODTK).
Phương pháp tiến hành
Bảng 2.3. Các bƣớc chuẩn bị mẫu enzym để đo hoạt tính
Dung dịch hóa chất Ống nghiệm
Mẫu thử Đối chứng
Dung dịch casein 1% (ml) 5 5
Dung dịch TCA 5% (ml) 0 10
Dung dịch enzym mẫu (ml) 1 1
Lắc đều và giữ ở 35,5oC trong 20 phút
Dung dịch TCA 5% (ml) 10 0
Để yên 30 phút, lọc lấy dịch trong
Lấy 6 ống nghiệm sạch, khô, tiến hành với 3 ống mẫu và 3 ống đối chứng. Lấy 2 ống nghiệm mới khác, cho vào ống thứ nhất 5 ml dịch lọc của ống thử thật và cho vào ống thứ hai 5 ml dịch lọc của ống đối chứng.
Tiếp tục thêm vào mỗi ống 10 ml NaOH 0,5N và 3 ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bƣớc sóng 660 nm. Tính ΔOD = ODTT – ODTK, sau đó dựa vào đồ thị chuẩn suy ra đƣợc số µM tyrosin.
Tính kết quả
Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lƣợng enzym tối thiểu trong
điều kiện thí nghiệm (35,5 oC, pH 7,6) thủy phân casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hòa tan trong TCA (tricloro acid), phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bƣớc sóng 660 nm tƣơng ứng với 1µM tyrosin trong đƣờng chuẩn.
Với: X: Số micromol tyrosin suy ra từ đƣờng chuẩn. V: Tổng thể thích hỗn hợp phản ứng enzyme (11 ml) v: Thể tích dịch lọc đem phân tích (1 ml)
K: Độ pha loãng mẫu
T: Thời gian phản ứng (phút)
UI (Anson) = 1 micromol tyrosin/ml/phút hoặc 1 micromol tyrosin/mg /phút
2.2.5. Sàng lọc các đột biến sinh protease cao từ Bacillus subtilis bằng xử lý chiếu xạ chiếu xạ
Huyền dịch tế bào sau nuôi cấy thứ cấp khoảng 4h đƣợc xử lý chiếu xạ dải liều 0-3000 Gy. Pha loãng dịch nuôi sau chiếu xạ tới nồng độ thích hợp và cấy trải trên đĩa petri chứa môi trƣờng NA sao cho mỗi đĩa chứa khoảng 50-200 khuẩn lạc riêng rẽ, ủ đĩa ở 37oC trong 24 giờ.
Các khuẩn lạc đơn sẽ đƣợc lựa chọn ngẫu nhiên (50 khuẩn lạc cho mỗi liều chiếu) để nuôi riêng rẽ trên môi trƣờng NB và kiểm tra khả năng sinh protease bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch-casein. So sánh đƣờng kính vòng phân giải, những khuẩn lạc sinh protease có kích thƣớc vòng phân giải casein lớn hơn 10% so với chủng thuần đƣợc xem là các đột biến sinh protease cao. Tần số đột biến sinh protease cao ở mỗi liều chiếu xạ đƣợc tính theo công thức:
2.2.6. Sàng lọc các đột biến sinh protease cao từ Bacillus subtilis bằng xử lý chiếu xạ kết hợp với kháng sinh
Sau khi chiếu xạ ở các liều khác nhau trong dải liều 0-3000 Gy, huyền dịch tế bào B. subtilis ngay lập tức đƣợc trải lên môi trƣờng NA có bổ sung rifampicin và streptomycin (đối chứng dƣơng của lô thí nghiệm là dịch nuôi cấy sau chiếu xạ đƣợc trải lên môi trƣờng NA không kháng sinh). Quan sát và thống kê số lƣợng khuẩn lạc mọc lên từ sau 1-3 ngày, đây là những khuẩn lạc vừa kháng xạ vừa kháng kháng sinh. Tần số đột biến kháng rifampicin ở mỗi liều chiếu xạ là tỷ số giữa số lƣợng khuẩn lạc B. subtilis sống sót trên môi trƣờng bổ sung KS và và số khuẩn lạc ở lô đối chứng dƣơng.
Các khuẩn lạc đơn kháng xạ và kháng kháng sinh sẽ đƣợc lựa chọn để nuôi riêng rẽ trên môi trƣờng NB và kiểm tra khả năng sinh protease bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch-casein. Những khuẩn lạc sinh protease với kích thƣớc vòng phân giải casein lớn hơn 10% so với chủng thuần đƣợc xem là các đột biến sinh protease cao tiềm năng.
2.2.7. Xác định đột biến
2.2.7.1. Thiết kế mồi và xử lý số liệu
- Phần mềm thiết kế mồi: phần mềm Fast PCR đƣợc lựa chọn sử dụng trong nghiên cứu bởi ƣu điểm dễ sử dụng và linh hoạt. Các mồi đƣợc thiết dựa vào trình tự gen
rpoB và rpsL của B. subtilis trong Databank (NC_000964.3 và D64127.1) và sử
dụng phần mềm online Fast PCR.
- Phần mềm so sánh trình tự nucleotide và amino acid: Sử dụng BlastN và BlastX (NBCI) để phân tích các trình tự tƣơng đồng trong ngân hàng dữ liệu Databank và xác định các nucleotide bị đột biến dẫn đến thay thế các amino acid trong protein
rpoB và rpsL12. Danh sách mồi sử dụng trong nghiên cứu đƣợc trình bày ở bảng
2.4.
Bảng 2.4. Trình tự nucleotide của các mồi dùng trong nghiên cứu
Tên mồi Trình tự mồi (5’ - 3’) Số nucleotide % GC Tm rpsL-F CGGTTTAAGCGTATGGAGC 19 52,63 56,52 rpsL-R GCTCCATACGCTTAAACCG 19 52,63 56,52 rpoB-F GAACCACCTGGGTATGTGGG 20 60 60,03 rpoB-R TGGCATCTGAATATCCTCCCTTC 23 47,83 59,67
2.2.7.2. Khuếch đại trình tự gen rpoB và rpsL12
Các cặp mồi đƣợc thiết kế theo chƣơng trình Fast PCR, đƣợc sử dụng để khuếch đại trình tự hai gen rpoB và rpsL12 từ DNA tổng số của hai chủng Bacillus B5 và H12 và 17 khuẩn lạc có khả năng sinh protease cao. Điều kiện tối ƣu và thành phần của phản ứng PCR đƣợc trình bày trong Bảng 2.4.
Bảng 2.5. Thành phần và chƣơng trình PCR khuếch đại trình tự hai gen rpoB và
rpsL12từ DNA tổng số
Thành phần Thể tích
(µl) Chƣơng trình PCR
H2O 8,2
- 94 oC trong 5 phút
- Lặp lại 40 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm (94 oC 30 giây, 55 oC 30 giây, 72 oC 30 giây) - 72 oC trong 10 phút Đệm 5X (Promega) 3,0 MgCl2 25 mM 1,2 dNTP 2 mM mỗi loại 0,5 rpoB-F (hoặc rpsL-F) 10 µM 0,5 rpoB-R (hoặc rpsL-R) 10 µM 0,5 Taq DNA polymerase 5 U/µl 0,1 Dung dịch chứa khuẩn lạc 1,0
Tổng 15,0
2.2.7.3. Tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng High Pure PCR Product Purification Kit của hãng Roche. Quy trình đƣợc thực hiện theo đúng hƣớng dẫn của nhà sản xuất. 2.2.7.4. Phƣơng pháp điện di DNA
Điện di là phƣơng pháp phân tách các đoạn DNA có kích thƣớc và cấu hình khác nhau. Dƣới tác dụng của điện trƣờng trong đệm trung tính, các đoạn DNA tích điện âm sẽ di chuyển về cực dƣơng, đoạn kích thƣớc nhỏ hơn sẽ di chuyển nhanh hơn. Trong nghiên cứu sử dụng loại giá thể agarose ở nồng độ 1% (với DNA tổng số) và 1,5% (các sản phẩm PCR có kích thƣớc khoảng 500 bp). Cả 2 loại gel agarose đều đƣợc chạy trong đệm TBE 1X (với thành phần trong 100ml nhƣ sau: 1,08 g tris-base; 0,55 g boric acid; 400 µl EDTA 0,5 M pH 8). Sau khi kết thúc điện di, DNA đƣợc nhuộm với ethidium bromide và phát hiện dƣới tia UV của hệ thống máy chụp ảnh gel UVP (Mỹ).
2.2.7.5. Giải trình tự
Sản phẩm PCR đƣợc giải trình tự trên hệ thống máy đọc tự động do Công ty First One (Hàn Quốc) thực hiện.
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. TUYỂN CHỌN CHỦNG Bacillus subtilis CÓ KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CAO LÀM NGUYÊN LIỆU GÂY TẠO ĐỘT BIẾN PROTEASE CAO LÀM NGUYÊN LIỆU GÂY TẠO ĐỘT BIẾN
3.1.1. Tuyển chọn các chủng Bacillus subtilis có hoạt tính cao và ổn định
Chín chủng B. subtilis thuần có khả năng sinh protease đã thu thập, đƣợc nuôi
cấy riêng rẽ trên môi trƣờng NB trong 24 giờ. Hoạt tính protease của chúng đƣợc định tính trên đĩa thạch-casein và nhuộm bằng thuốc nhuộm amido đen, kết quả thu đƣợc trình bày trong Bảng 3.1 và Hình 3.1.
Bảng 3.1. Kích thƣớc vòng phân giải casein của 09 chủng B. subtilis có khả năng sinh protease
STT Tên chủng Kí hiệu Đƣờng (mm) kính 1 B5 1 18,5 ± 0,25 2 H12 2 18,5 ± 0,25 3 NH 3 - 4 VI 4 18,75 ± 0,5 5 TN 5 8 ± 0 6 PN 6 8 ± 0 7 002 7 - 8 131 8 15,25 ± 0,25 9 129 9 17,25 ± 0,25
Hình 3.1. Vòng phân giải casein của 09 chủng B. subtilis có khả năng sinh protease
*Thí nghiệm được lặp lại trên 3 đĩa và 2 lần trên cùng một đĩa casein cho mỗi
chủng;(-) không có vòng phân giải
Bƣớc đầu kiểm tra, 05 chủng có đƣờng kính phân giải casein lớn hơn các chủng còn lại đƣợc lựa chọn để tiếp tục tuyển chọn các chủng có hoạt tính vƣợt trội và ổn định. Đó là các chủng B5, H12, VI, 131 và 129.
Kiểm tra lại hoạt tính protease của 05 chủng nhận thấy các chủng B5, H12 và VI cho vòng phân giải casein lớn hơn và có tính ổn định giữa các lô thí nghiệm so với 02 chủng còn lại (Hình 3.2 và Bảng 3.2). Kết quả định lƣợng protease của 5
chủng bằng phƣơng pháp Anson cải tiến đƣợc trình bày trong Hình 3.3.
Bảng 3.2. Kích thƣớc vòng phân giải casein của 05 chủng có khả năng sinh protease ST T Tên chủng Kí hiệu Đƣờng kính (mm) 1 B5 1-1‟ 18,5 ± 0,25 2 H12 2-2‟ 18,5 ± 0 3 VI 4-4‟ 18,25± 0,5 4 131 8-8‟ - 5 129 9 16,75 129 9‟ -
Hình 3.2. Vòng phân giải casein của 05 chủng có khả năng sinh protease cao
*Thí nghiệm được lặp lại trên 3 đĩa và 2 lần trên cùng một đĩa casein cho mỗi chủng;(-) không có vòng phân giải.
Hình 3.3. Hoạt độ protease của các chủng B. subtilis tuyển chọn
Kết quả (Hình 3.2) cho thấy chủng 129 tƣơng ứng với ký hiệu số 9, 9,, trên đĩa thạch có khả năng sinh protease không ổn định giữa hai lần thí nghiệm còn 3