Bacillus subtilis
Chiếu xạ là quá trình truyền năng lƣợng điển hình của bức xạ cho đối tƣợng bị chiếu xạ. Khi chiếu xạ các chủng vi khuẩn ở dạng dung dịch nuôi cấy, cơ chế tác động gián tiếp của bức xạ ion sẽ chiếm ƣu thế so với tác động trực tiếp. Mặt khác, tăng hàm lƣợng nƣớc cũng làm tăng ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ lên vi sinh vật do sự gia tăng quá trình hình thành các gốc tự do từ các phân tử nƣớc gây ra bởi bức xạ. Vì vậy, chiếu xạ vi khuẩn trong dung dịch nuôi cấy có thể gây ra những tổn
giả thuyết này, phƣơng án chiếu xạ dung dịch nuôi cấy vi khuẩn sẽ đƣợc lựa chọn để sàng lọc các chủng B. subtilis kháng xạ có khả năng sinh protease cao.
Các khuẩn lạc đơn kháng xạ sẽ đƣợc lựa chọn ngẫu nhiên (50 khuẩn lạc cho mỗi liều chiếu) để nuôi riêng rẽ trên môi trƣờng NB và kiểm tra khả năng sinh protease bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch-casein. Những khuẩn lạc có kích thƣớc vòng phân giải casein lớn hơn 10% so với chủng thuần đƣợc xem là các đột biến sinh protease cao. Tỷ lệ đột biến sinh protease cao ở các chủng B. subtilis tại mỗi liều chiếu xạ đƣợc trình bày trong Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Tỷ lệ đột biến sinh protease cao của 3 chủng B. subtilis tại các liều chiếu xạ khác nhau
Liều chiếu (Gy)
Tỷ lệ đột biến (%) sinh protease cao
B. subtilis B5 B. subtilis H12 B. subtilis VI
100 5,00±0,50 6,00±0,00 4,33±0,28 300 7,33±0,67 7,67±0,39 5,67±0,28 500 8,00±0,37 8,33±0,56 7,67±0,28 700 13,00±0,67 12,33±0,56 15,33±0,44 1000 14,33±0,72 17,00 ±0,67 16,00±0,33 1500 12,67±0,37 16,33±0,78 15,67±0,56 2000 7,33±0,44 9,00±0,50 10,33±0,28 3000 5,33±0,28 7,00±0,50 8,67±0,44
Tỷ lệ đột biến thƣờng liên quan tới liều chiếu xạ (Hoe và cs, 2016). Kết quả cho thấy đột biến sinh protease cao xuất hiện ở tất cả các liều xạ, tỷ lệ đột biến dƣờng nhƣ cao hơn trong khoảng liều từ 700-1500 kGy so với các liều khảo sát còn lại và kết quả lặp lại ở cả 3 chủng B. subtilis B5, H12 và VI. Nhƣ vậy, dựa vào đƣờng cong sống sót phụ thuộc liều chiếu xạ của 3 chủng vi khuẩn này (Hình 3.7) nhận thấy đột biến sinh protease lớn hơn chủng thuần thu đƣợc nhiều hơn khi số lƣợng tế bào sống sau chiếu xạ giảm từ 1000 đến 10 000 lần (3-4 đơn vị Log) so với dạng thuần không chiếu xạ.
Kết quả thu đƣợc phù hợp với nghiên cứu của Afsharmaesh & cs khi sử dụng bức xạ gamma làm tác nhân gây đột biến ngẫu nhiên với chủng B. subtilis UTB1 để làm tăng khả năng sinh hợp chất lipopeptide dùng phân hủy độc tố aflatoxin của nấm Aspergillus flavus. Tỷ lệ đột biến mong muốn cao nhất ở chủng này đạt đƣợc tại liều 2-3 kGy, cũng là liều làm số lƣợng tế bào sống giảm từ 3-4 đơn vị Log so với mẫu đối chứng không chiếu xạ (Afsharmaesh và cs, 2014).
Trong một nghiên cứu khác Yoon Ki-Hong chiếu xạ chủng Bacillus sp. 79-23 bằng bức xạ gamma trên nguồn Co-60, dải liều từ 3000- 5000 Gy đƣợc lựa chọn để sàng các chủng đột biến kháng xạ có khả năng sinh CMCase cao hơn 1,5-2 lần so với chủng thuần. Tại khoảng liều này các tác giả nhận thấy số lƣợng tế bào sống sót sau chiếu xạ xấp xỉ 1-5% (Yoon và cs, 1999). Đối với 3 chủng B. subtilis trong
nghiên cứu này số lƣợng tế bào sống sót sau chiếu xạ không quá 3% ở khoảng liều 700-1500 Gy.
Nghiên cứu của GuiJun đã sử dụng bức xạ gamma với liều chiếu từ 100 đến 2000 Gy trên B. subtilis NCD-2 với mục đích tạo ra các thể đột biến có khả năng ức chế Verticillium dahliae Kleb một loại vi khuẩn gây bệnh thực vật, kết quả chỉ ra tỉ lệ chết tăng theo liều chiếu. Với liều 1000 Gy tỉ lệ chết lên đến 99,5%. Tần số đột biến tăng dần trong khoảng liều từ 100 Gy đến 500 Gy và giảm dần từ liều lớn hơn 500 Gy. Liều chiếu từ 400 Gy đến 700 Gy cho tần suất đột biến cao (trung bình trên 15%) và tần suất cao nhất đạt 26,51% tại liều 500 Gy (GuiJun và cs, 2011).
Để tạo ra các đột biến vi sinh vật bằng bức xạ gamma, các phƣơng pháp với liều lƣợng bức xạ và điều kiện chiếu xạ khác nhau đã đƣợc công bố và tổng hợp (Hoe và cs, 2016). Tuy nhiên, không có bất kỳ một khuyến cáo chung nào về khoảng liều tối ƣu để đạt đƣợc tỷ lệ đột biến cao do ảnh hƣởng của bức xạ tới mỗi loài hay chủng VSV là không giống nhau. Do đó, việc xác định liều chiếu tối ƣu gây đột biến vi khuẩn là không đơn giản. Việc xây dựng đƣờng cong sống sót phụ thuộc liều, cũng nhƣ tổng hợp các nghiên cứu có liên quan để có đƣợc thông tin về hiệu quả của liều xử lý, điều kiện chiếu xạ, … là cần thiết để xác định khoảng liều phù hợp cho các đột biến mong muốn.