SUBTILIS VÀ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA CHÚNG 3.2.1. Đánh giá quá trình sinh trƣởng của các chủng Bacillus subtilis
Với mục đích chọn đƣợc thời điểm mà sự sinh trƣởng thích hợp cho việc xử lý chiếu xạ, đƣờng cong sinh trƣởng của 3 chủng tiềm năng B. subtilis B5, H12 và VI đã đƣợc khảo sát.
Các chủng B. subtilis B5, H12 và VI đƣợc nuôi cấy lắc 120 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ 37 oC để thu đƣợc huyền dịch tế bào sơ cấp. Dịch sơ cấp đƣợc chuyển sang môi trƣờng NB (tỷ lệ 1/100) và tiếp tục nuôi cấy lắc ở 37 oC. Mật độ tế bào đƣợc xác định thông qua giá trị OD của dịch nuôi cấy vi khuẩn ở bƣớc sóng 550 nm tại các thời điểm 0, 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16 và 24 giờ. Đƣờng cong sinh trƣởng của 3 chủng B. subtilis đƣợc trình bày trong Hình 3.6
Hình 3.6. Đƣờng cong sinh trƣởng của các chủng Bacillus subtilis tiềm năng (♦ - B5, ■ - H12 và ▲ – VI)
Dựa vào đồ thị Hình 3.6 cùng kết quả số liệu đo OD, chúng tôi nhận thấy giai đoạn pha Log của 3 chủng vi khuẩn là từ 2-6 giờ. Thời điểm 8 h giá trị OD đạt cao nhất và ổn định tới 14 h sau nuôi cấy. Tại các thời điểm dài hơn, độ đục của dịch nuôi cấy giảm, giá trị OD là 0,71, 0,48 và 0,45 tƣơng ứng với các chủng B5, H12 và VI sau 24 giờ nuôi cấy (số liệu không thể hiện trên hình). Điều này có thể đƣợc giải thích bởi các tế bào kết lại với nhau thành đám có thể quan sát rõ bằng mắt thƣờng, dịch nuôi cấy trong hơn do vậy giá trị đo OD cũng giảm theo.
Nhƣ vậy, đối với xử lý chiếu xạ dịch nuôi cấy: sau khoảng 4 giờ nuôi cấy thứ cấp khi quá trình sinh trƣởng của các chủng B. subtilis ở pha Log (OD550= 0,6-0,7), dịch nuôi sẽ đƣợc đem xử lý chiếu xạ các liều khác nhau trên nguồn gamma Co-60.
3.2.2. Ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng sống sót của các chủng
Bacillus subtilis
+ Xử lý chiếu xạ dịch nuôi cấy Bacillus subtilis
Tác động của bức xạ gamma tới khả năng sống sót của 03 chủng B. subtilis
đƣợc đánh giá định tính bằng phƣơng pháp nhỏ trực tiếp 5 µl dịch nuôi cấy thứ cấp đã xử lý chiếu xạ liều khác nhau lên cùng một đĩa petri chứa môi trƣờng NA, đĩa đƣợc nuôi cấy ở 37 o
C và quan sát sau 24 giờ. Kết quả cho thấy với cùng một thể tích huyền dịch tế bào đƣợc nuôi cấy có sự khác biệt rõ rệt về mật độ quần thể giữa các mẫu vi khuẩn đƣợc chiếu xạ và không chiếu xạ nhƣ đƣợc chỉ ra trong Hình 3.7- A. Số lƣợng khuẩn lạc dƣờng nhƣ phụ thuộc vào liều bức xạ. Chúng nhanh chóng giảm ở các mẫu đƣợc chiếu xạ ở liều cao hơn 700 Gy và chỉ có thể thấy một vài khuẩn lạc đối với mẫu đƣợc chiếu xạ ở 3000 Gy.
Tác động của bức xạ gamma tại các liều chiếu khác nhau tới các chủng B. subtilis còn đƣợc xác định thông qua việc đếm số khuẩn lạc B. subtilis ở cả dịch
nuôi cấy xử lý chiếu xạ và không chiếu xạ. Rõ ràng khả năng sống sót của vi khuẩn bị ảnh hƣởng đáng kể bởi bức xạ gamma, tỷ lệ tế bào sống sót ở cả 3 chủng vi khuẩn đều giảm khi tăng liều bức xạ. Tác động của bức xạ đối với cả 3 chủng B.
subtilis đƣợc biểu diễn nhƣ hàm logarit của các tế bào sống sót (CFU/ml) với liều
A B
Hình 3.7. Mối tƣơng quan giữa số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis sống sót trong dịch nuôi cấy và liều chiếu xạ
Kết quả cũng cho thấy đƣờng cong sống sót của B. subtilis phụ thuộc liều
chiếu xạ dƣờng nhƣ là đƣờng cong dạng hai pha “bimodal” với độ nhạy cảm phóng xạ giảm dần của các tế bào ở liều xử lý cao hơn 1500 Gy. Sự kết hợp của vi khuẩn
để hình thành các cụm tế bào lớn hơn trong quá trình chiếu xạ có thể đã làm tăng khả năng kháng xạ của B. subtilis ở các liều xử lý cao hơn này (Yazdi và Ardekani, 2012).
Nghiên cứu khả năng sống sót của bào tử Bacillus sp. bởi bức xạ gamma, Yoon Ki-Hong và cs nhận thấy tỷ lệ sống sót của bào tử Bacillus sp. 79-23 chiếu xạ giảm theo cấp số nhân trong dải liều dao động từ 0,5 đến 5 kGy. Ở 3 và 5 kGy số lƣợng TB còn lại tƣơng ứng xấp xỉ 5% và 1% (Yoon và cs, 1999). Trong một nghiên cứu khác, Bacillus sp. NMBCC 10023 ban đầu đƣợc phân lập từ đất đã đƣợc chiếu xạ với liều 1-40 kGy trên nguồn Co-60. Kết quả là tỷ lệ sống sót của vi khuẩn giảm tuyến tính khi liều chiếu xạ tăng tới 10 kGy. Liều chiếu trên 10 kGy có khả năng tiêu diệt hoàn toàn vi khuẩn và giá trị D10 của chủng Bacillus sp. NMBCC 10023 này nằm trong khoảng 2-4 kGy (Jong và cs, 2010). Gui Jun và cs báo cáo rằng tỷ lệ chết của B. subtilis NCD-2 tăng theo liều chiếu xạ gamma trong khoảng 100 đến 2000 Gy và ở liều 1000 Gy tỉ lệ chết lên đến 99,5% (GuiJun và cs, 2011). Xử lý chiếu xạ tia gamma chủng B. subtilis UTB1 ở dải liều 100 – 3000 Gy Afsharmaesh & cs cũng nhận thấy tỷ lệ sống sót của chủng UTB1 tỷ lệ nghịch với liều chiếu xạ và mối tƣơng quan giữa số lƣợng vi khuẩn sống sót (Log Scale) và liều xử lý dƣờng nhƣ theo một mô hình khá tuyến tính (linear model) (Afsharmaesh và cs, 2014).
Những khác biệt này có thể giải thích khi cho rằng các yếu tố nhƣ nhiệt độ, giai đoạn sinh trƣởng, bản chất của môi trƣờng dạng khí, thành phần hóa học của môi trƣờng nuôi cấy… cũng nhƣ điều kiện sinh lý và khả năng tự chữa sửa của tế bào đã ảnh hƣởng đến sự tồn tại của chúng sau chiếu xạ.
3.2.3. Ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng sinh protease của các chủng
Bacillus subtilis
Chiếu xạ là quá trình truyền năng lƣợng điển hình của bức xạ cho đối tƣợng bị chiếu xạ. Khi chiếu xạ các chủng vi khuẩn ở dạng dung dịch nuôi cấy, cơ chế tác động gián tiếp của bức xạ ion sẽ chiếm ƣu thế so với tác động trực tiếp. Mặt khác, tăng hàm lƣợng nƣớc cũng làm tăng ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ lên vi sinh vật do sự gia tăng quá trình hình thành các gốc tự do từ các phân tử nƣớc gây ra bởi bức xạ. Vì vậy, chiếu xạ vi khuẩn trong dung dịch nuôi cấy có thể gây ra những tổn
giả thuyết này, phƣơng án chiếu xạ dung dịch nuôi cấy vi khuẩn sẽ đƣợc lựa chọn để sàng lọc các chủng B. subtilis kháng xạ có khả năng sinh protease cao.
Các khuẩn lạc đơn kháng xạ sẽ đƣợc lựa chọn ngẫu nhiên (50 khuẩn lạc cho mỗi liều chiếu) để nuôi riêng rẽ trên môi trƣờng NB và kiểm tra khả năng sinh protease bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch-casein. Những khuẩn lạc có kích thƣớc vòng phân giải casein lớn hơn 10% so với chủng thuần đƣợc xem là các đột biến sinh protease cao. Tỷ lệ đột biến sinh protease cao ở các chủng B. subtilis tại mỗi liều chiếu xạ đƣợc trình bày trong Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Tỷ lệ đột biến sinh protease cao của 3 chủng B. subtilis tại các liều chiếu xạ khác nhau
Liều chiếu (Gy)
Tỷ lệ đột biến (%) sinh protease cao
B. subtilis B5 B. subtilis H12 B. subtilis VI
100 5,00±0,50 6,00±0,00 4,33±0,28 300 7,33±0,67 7,67±0,39 5,67±0,28 500 8,00±0,37 8,33±0,56 7,67±0,28 700 13,00±0,67 12,33±0,56 15,33±0,44 1000 14,33±0,72 17,00 ±0,67 16,00±0,33 1500 12,67±0,37 16,33±0,78 15,67±0,56 2000 7,33±0,44 9,00±0,50 10,33±0,28 3000 5,33±0,28 7,00±0,50 8,67±0,44
Tỷ lệ đột biến thƣờng liên quan tới liều chiếu xạ (Hoe và cs, 2016). Kết quả cho thấy đột biến sinh protease cao xuất hiện ở tất cả các liều xạ, tỷ lệ đột biến dƣờng nhƣ cao hơn trong khoảng liều từ 700-1500 kGy so với các liều khảo sát còn lại và kết quả lặp lại ở cả 3 chủng B. subtilis B5, H12 và VI. Nhƣ vậy, dựa vào đƣờng cong sống sót phụ thuộc liều chiếu xạ của 3 chủng vi khuẩn này (Hình 3.7) nhận thấy đột biến sinh protease lớn hơn chủng thuần thu đƣợc nhiều hơn khi số lƣợng tế bào sống sau chiếu xạ giảm từ 1000 đến 10 000 lần (3-4 đơn vị Log) so với dạng thuần không chiếu xạ.
Kết quả thu đƣợc phù hợp với nghiên cứu của Afsharmaesh & cs khi sử dụng bức xạ gamma làm tác nhân gây đột biến ngẫu nhiên với chủng B. subtilis UTB1 để làm tăng khả năng sinh hợp chất lipopeptide dùng phân hủy độc tố aflatoxin của nấm Aspergillus flavus. Tỷ lệ đột biến mong muốn cao nhất ở chủng này đạt đƣợc tại liều 2-3 kGy, cũng là liều làm số lƣợng tế bào sống giảm từ 3-4 đơn vị Log so với mẫu đối chứng không chiếu xạ (Afsharmaesh và cs, 2014).
Trong một nghiên cứu khác Yoon Ki-Hong chiếu xạ chủng Bacillus sp. 79-23 bằng bức xạ gamma trên nguồn Co-60, dải liều từ 3000- 5000 Gy đƣợc lựa chọn để sàng các chủng đột biến kháng xạ có khả năng sinh CMCase cao hơn 1,5-2 lần so với chủng thuần. Tại khoảng liều này các tác giả nhận thấy số lƣợng tế bào sống sót sau chiếu xạ xấp xỉ 1-5% (Yoon và cs, 1999). Đối với 3 chủng B. subtilis trong
nghiên cứu này số lƣợng tế bào sống sót sau chiếu xạ không quá 3% ở khoảng liều 700-1500 Gy.
Nghiên cứu của GuiJun đã sử dụng bức xạ gamma với liều chiếu từ 100 đến 2000 Gy trên B. subtilis NCD-2 với mục đích tạo ra các thể đột biến có khả năng ức chế Verticillium dahliae Kleb một loại vi khuẩn gây bệnh thực vật, kết quả chỉ ra tỉ lệ chết tăng theo liều chiếu. Với liều 1000 Gy tỉ lệ chết lên đến 99,5%. Tần số đột biến tăng dần trong khoảng liều từ 100 Gy đến 500 Gy và giảm dần từ liều lớn hơn 500 Gy. Liều chiếu từ 400 Gy đến 700 Gy cho tần suất đột biến cao (trung bình trên 15%) và tần suất cao nhất đạt 26,51% tại liều 500 Gy (GuiJun và cs, 2011).
Để tạo ra các đột biến vi sinh vật bằng bức xạ gamma, các phƣơng pháp với liều lƣợng bức xạ và điều kiện chiếu xạ khác nhau đã đƣợc công bố và tổng hợp (Hoe và cs, 2016). Tuy nhiên, không có bất kỳ một khuyến cáo chung nào về khoảng liều tối ƣu để đạt đƣợc tỷ lệ đột biến cao do ảnh hƣởng của bức xạ tới mỗi loài hay chủng VSV là không giống nhau. Do đó, việc xác định liều chiếu tối ƣu gây đột biến vi khuẩn là không đơn giản. Việc xây dựng đƣờng cong sống sót phụ thuộc liều, cũng nhƣ tổng hợp các nghiên cứu có liên quan để có đƣợc thông tin về hiệu quả của liều xử lý, điều kiện chiếu xạ, … là cần thiết để xác định khoảng liều phù hợp cho các đột biến mong muốn.
3.3. XỬ LÝ CHIẾU XẠ KẾT HỢP SỬ DỤNG KS GÂY ĐỘT BIẾN ĐỊNH HƢỚNG TỚI CÁC GEN MÃ CHO SẢN PHẨM LIÊN QUAN TỚI QUÁ HƢỚNG TỚI CÁC GEN MÃ CHO SẢN PHẨM LIÊN QUAN TỚI QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA CHỦNG BACILLUS SUBTILIS
Bacillus sp. là một trong số các vi sinh vật mô hình phù hợp với các hƣớng nghiên cứu về sự cải biến di truyền khi điều kiện môi trƣờng thay đổi theo hƣớng bất lợi (Ochi và Hosaka, 2013). Chính vì vậy, chúng là đích trong công nghệ ribosome với tác nhân đột biến là các chất kháng sinh nhằm làm tăng khả năng sinh tổng hợp sản phẩm thứ cấp. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, các đột biến kháng kháng sinh ở Bacillus sp. có khả năng tăng sản xuất enzyme ngoại bào (Ochi, 2007; Wang và cs, 2008; Ochi và Hosaka, 2013). Một số chủng đột biến kháng streptomycin ở
cs, 2016). Thêm vào đó, lƣợng enzyme ngoại bào cũng tăng lên từ 1,6 – 3 lần khi gây đột biến gen rpoB ở Bacillus sp. (Hu và Ochi, 2000).
Trong nghiên cứu này, rifampicin và streptomycin đƣợc sử dụng nhƣ các tác nhân gây đột biến trên B. subtilis nhằm thu đƣợc chủng kháng kháng sinh sản xuất protease tối đa. Đồng thời, xử lý kháng sinh cũng đƣợc kết hợp với chiếu xạ gamma nhằm tăng áp lực chọn lọc và tỷ lệ đột biến, cũng nhƣ làm giảm thời gian sàng lọc đối với các đột biến mong muốn.
3.3.1. Xử lý chiếu xạ kết hợp với kháng sinh streptomycin
3.3.1.1. Ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng kháng streptomycin ở các chủng Bacillus subtilis chủng Bacillus subtilis
Huyền dịch tế bào của 3 chủng B. subtilis B5, H12 và VI sau khi chiếu xạ ở các liều khác nhau trong dải liều 0-3000 Gy ngay lập tức đƣợc trải lên môi trƣờng NA có bổ sung streptomycin nồng độ 20 µg/ml (đối chứng dƣơng của lô thí nghiệm là dịch nuôi cấy sau chiếu xạ đƣợc trải lên môi trƣờng NA không kháng sinh). Quan sát và thống kê số lƣợng khuẩn lạc mọc lên từ sau 1-3 ngày để tìm kiếm những khuẩn lạc vừa kháng xạ vừa kháng kháng sinh. So sánh kết quả thu đƣợc với số lƣợng khuẩn lạc sống sót sau chiếu xạ ở mỗi liều để tính toán tần số đột biến kháng streptomycin 20 µg/ml của các chủng B. subtilis ở mỗi liều chiếu xạ (Hình 3.8 ).
Hình 3.8. Tần số đột biến kháng streptomycin 20 µg/ml của 03 chủng B. subtilis
Trong tự nhiên, tần số đột biến phụ thuộc vào điều kiện phát triển của vi sinh vật và nằm trong khoảng từ 10-10 đến 10-6. Tần số này có thể tăng một cách rõ rệt bằng cách sử dụng các tác nhân gây đột biến thực nghiệm và thực tế có thể lên đến 10-5 đến 10-1 (Davati và cs, 2013).
Cả 3 chủng B. subtilis B5, H12 và VI sau chiếu xạ đều không xuất hiện bất kỳ một khuẩn lạc đột biến kháng kháng sinh nào trên các đĩa thạch NA có bổ sung 20 µg/ml streptomycin đƣợc cấy huyền dịch tế bào chiếu xạ liều lớn hơn 1200 Gy. Sau 24-48 giờ nuôi cấy, chỉ có những khuẩn lạc đột biến từ các tế bào đƣợc chiếu xạ ở liều dƣới 1000 Gy xuất hiện với số lƣợng khác nhau ở mỗi chủng vi khuẩn nghiên cứu. Có thể thấy rằng tần số đột biến tăng khi tăng liều bức xạ. Tần số biến lớn nhất là 1,61x10-3, 1,68x10-2, 2,22x10-2 tƣơng ứng lần lƣợt với các chủng B5, H12 và VI gây ra bởi liều chiếu xạ 1000 Gy. Tần số nhỏ hơn 3,09x10-6, 5,52x10-5, 7,35x10-5 gây ra bởi chiếu xạ ở 100 Gy. Kết quả cũng cho thấy tần số đột biến tự phát của các chủng B5, H12 và VI lần lƣợt là 1,78 x10-6, 1,52x10-6 và 6,67x10-6. Những kết quả thu đƣợc chứng tỏ khả năng kháng streptomycin của các chủng B. subtilis đã đƣợc cải thiện nhờ xử lý chiếu xạ.
3.3.1.2. Sàng lọc các khuẩn lạc Bacillus subtilis có khả năng sinh protease cao từ
các chủng kháng xạ và kháng streptomycin
Sàng lọc khuẩn lạc kháng xạ và kháng streptomycin 20 µg/ml
Các khuẩn lạc đơn kháng streptomycin 20 µg/ml (ở mỗi liều chiếu từ 0-1000 Gy) sẽ đƣợc nuôi riêng rẽ trên môi trƣờng NB và kiểm tra khả năng sinh protease bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch-casein. So sánh đƣờng kính vòng phân giải, những khuẩn lạc có kích thƣớc vòng phân giải casein lớn hơn 10% so với chủng thuần đƣợc xem là các đột biến sinh protease cao.
Ở nồng độ kháng sinh 20 µg/ml, từ chủng B. subtilis B5 chúng tôi chọn đƣợc 25 khuẩn lạc tiềm năng có vòng phân giải casein lớn hơn chủng thuần (gọi là khuẩn lạc KKS-20), trong đó ở liều 100 Gy thu đƣợc 10 khuẩn lạc, liều 300 Gy thu đƣợc 10 khuẩn lạc và liều 500 Gy thu đƣợc 5 khuẩn lạc. Ở liếu chiếu xạ 700 và 1000 Gy (Bảng 3.4), chúng tôi đã không thu đƣợc khuẩn lạc tiềm năng nào từ chủng Bacillus
subtilis B5 kháng streptomycin 20 µg/ml.
một khuẩn lạc tiềm năng nào ở tất cả các liều xử lý. Hosoya và cộng sự khi nghiên cứu với S. coelicolor A3(2) trên môi trƣờng bổ sung kháng sinh cũng nhận thấy bên cạnh những khuẩn lạc đột biến có khả năng sinh kháng sinh vƣợt trội so với chủng thuần, vẫn tồn tại các khuẩn lạc đột biến không có hiệu quả với việc sản xuất thuốc kháng sinh (Hosoya và cs, 2003)
Bảng 3.4.Số lƣợng khuẩn lạc kháng streptomycin 20 µg/ml có khả năng sinh