Nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hƣởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi khuẩn cũng nhƣ tính chất của enzyme đƣợc tổng hợp. Mỗi chủng vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp khác nhau. Tuy nhiên, đa số các vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme đều không bền với nhiệt độ và bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp. Nhiệt độ tối ƣu của B. subtilis sinh tổng hợp enzyme protease là 37 oC.
pH môi trường
Khi dùng phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt, pH của môi trƣờng thƣờng ít ảnh hƣởng đến quá trình tổng hợp enzyme ở vi sinh vật vì môi trƣờng bán rắn có tính đệm cao và hầu nhƣ không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật. Thông thƣờng, các vi khuẩn phát triển tốt và tạo nhiều enzyme ở pH trung tính 6,6 – 7,4 (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
Khi dùng phƣơng pháp nuôi cấy chìm, pH có ảnh hƣởng rất lớn đến sự tích lũy protease trong môi trƣờng. pH của môi trƣờng thay đổi sau khi thanh trùng môi trƣờng và đặc biệt thay đổi rất lớn trong quá trình nuôi cấy, pH ban đầu thích hợp cho phát triển của vi khuẩn khoảng 6,2 – 7,4. Trong quá trình nuôi cấy, tùy theo thành phần môi trƣờng và các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật, mà pH của môi trƣờng sẽ chuyển dần về phía axit hoặc kiềm.
Đối với các loài thuộc chi Bacillus, pH thƣờng chuyển về kiềm. Ngƣời ta có
thể căn cứ vào pH của môi trƣờng sau khi nuôi cấy để dự đoán lƣợng protease tích lũy trong môi trƣờng. Nhiều nghiên cứu cho thấy pH của môi trƣờng ảnh hƣởng tới tỷ lệ giữa các protease đƣợc tổng hợp. Do đó, nếu giữ pH của môi trƣờng ổn định trong suốt thời gian nuôi cấy, B. subtilis sẽ tạo một loại protease xác định chiếm ƣu thế trong môi trƣờng (Lê Ngọc Tú và cs, 1989; Ahn và cs, 1993)
Thời gian nuôi cấy
Các chủng vi sinh vật khác nhau có tốc độ sinh trƣởng khác nhau. Tốc độ sinh trƣởng của vi sinh vật trong đó có B. subtilis thƣờng liên quan đến thời gian nuôi
cấy và là yếu tố có vai trò rất quan trọng trong việc sinh tổng hợp enzyme. Mặt khác, yếu tố thời gian còn quyết định năng suất của việc sản xuất chế phẩm enzyme.
Thông thƣờng, enzyme đƣợc tổng hợp nhiều nhất trong môi trƣờng nuôi cấy tại một thời điểm nhất định. Ngoài ra, thời gian nuôi cấy còn phụ thuộc vào chủng giống, thành phần môi trƣờng, điều kiện nuôi cấy.
Độ thông khí
Oxy rất cần đối với đời sống vi sinh vật hiếu khí. Tăng sự thông khí đến giới hạn xác định thì sự phát triển của vi sinh vật cũng tăng theo. Đối với nhiều vi sinh vật, thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinh trƣởng, rút ngắn pha tiềm phát và nâng cao sinh khối. Lƣợng oxy thích hợp cho quá trình tổng hợp protease của các vi sinh vật khác nhau. Trong một số trƣờng hợp thiếu oxy tuy có kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật nhƣng lại tăng quá trình tổng hợp protease. Sự hiếu khí mạnh làm kìm hãm sự tổng hợp protease (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004)