3.3.2.1. Ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng kháng rifampicin ở các chủng
Bacillus subtilis
Sau khi chiếu xạ ở các liều khác nhau trong dải liều 0-3000 Gy, huyền dịch tế bào của 3 chủng B. subtilis B5, H12 và VI ngay lập tức đƣợc trải lên môi trƣờng
NA có bổ sung rifampicin nồng độ 0,2 µg/ml (đối chứng dƣơng của lô thí nghiệm là dịch nuôi cấy sau chiếu xạ đƣợc trải lên môi trƣờng NA không kháng sinh). Kết quả đánh giá tần số đột biến kháng rifampicin 0,2 µg/ml của các chủng B. subtilis ở mỗi liều chiếu xạ trong Hình 3.11 cho thấy, các chủng B. subtilis trong nghiên cứu có tần số đột biến tự phát kháng rifampicin 0,2 µg/ml là: 3,26x10-5, 7,6x10-5 và 8,4x10-
5
tƣơng ứng lần lƣợt với các chủng B5, H12 và VI. Tần số đột biến kháng rifampicin của các chủng Bacillus tăng lên nhờ xử lý chiếu xạ tia gamma. Tần số
đột biến tăng đáng kể khi liều chiếu tăng và đạt giá trị cao nhất ở liều 2000 Gy (1,78x10-1, 1,17x10-1 và 0,78x10-1 tƣơng ứng với chủng B5, H12 và VI), cao hơn tần số đột biến tự phát từ 0,93 – 5,46x103 lần. Ở các liều xử lý cao hơn (2500 và 3000 Gy) tần số đột biến có xu hƣớng giảm.
Hinh 3.11. Tần số đột biến kháng rifampicim 0,2 µg/ml của 03 chủng B. subtilis B5, H12 và VI ở các liều chiếu xạ khác nhau
Nghiên cứu khả năng kháng rifampicin 150 µg/ml của E. coli, Al-Sudany & cs nhận thấy tần số đột biến tự phát của chủng này là 0,48x10-12 và tần số này tăng lên nhờ xử lý chiếu xạ, tần số cao nhất đạt 3,4x1-12 ở liều 1Gy (Al-Sudany và cs, 2010).
Một số các nghiên cứu trên các chủng vi sinh vật khác cũng cho thấy xử lí chiếu xạ giúp tăng áp lực chọn lọc, tăng tần suất thu đƣợc thể đột biến mong muốn đặc biệt là tăng khả năng kháng với kháng sinh của vi sinh vật (De Groot và cs, 2005; Al-Sudany và cs, 2010).
3.3.2.2. Sàng lọc các khuẩn lạc Bacillus subtilis có khả năng sinh protease cao từ
các khuẩn lạc kháng xạ và kháng rifampicin
Các khuẩn lạc đơn kháng rifampicin 0,2 µg/ml sẽ đƣợc lựa chọn ngẫu nhiên (50 khuẩn lạc ở mỗi liều chiếu) để nuôi riêng rẽ trên môi trƣờng NB và kiểm tra khả năng sinh protease bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch-casein. So sánh đƣờng kính vòng phân giải, những khuẩn lạc có kích thƣớc vòng phân giải casein lớn hơn 10% so với chủng thuần đƣợc xem là các đột biến sinh protease cao.
Ở nồng độ kháng sinh 0,2 µg/ml, chúng tôi chọn đƣợc 82 khuẩn lạc tiềm năng (gọi là khuẩn lạc KKS-0,2). trong đó có 68 khuẩn lạc từ chủng B5 chiếu xạ và 14 khuẩn lạc từ chủng H12 chiếu xạ (Bảng 3.6). Không thu đƣợc khuẩn lạc tiềm năng nào từ chủng VI.
Bảng 3.6. Số lƣợng khuẩn lạc tiềm năng kháng rifampicin 0,2 µg/ml sinh protease cao đƣợc sàng lọc từ các chủng B. subtilis chiếu xạ
Liều chiếu
(Gy)
Số khuẩn lạc kháng rifampicin 0,2 µg/ml có vòng phân giải casein lớn hơn chủng thuần
B. subtilis B5 B. subtilis H12 100 10 5 300 7 5 500 11 - 700 10 3 1000 6 1 1500 13 - 2000 11 - 2500 - - 3000 - - Tổng 68 14
Với mục đích tăng áp lực chọn lọc, 82 khuẩn lạc này đƣợc tiếp tục sàng lọc ở nồng độ rifampicin cao hơn, là 0,4, 0,8, 1 và 2 µg/ml. Tuy nhiên, khi đẩy lên các nồng độ rifampicin cao hơn là 0,4, 0,8 và 1 µg/ml thì mật độ khuẩn lạc ở các đĩa khá dày, không thu đƣợc các khuẩn lạc riêng rẽ vì thế các nồng độ KS này sẽ không đƣợc lựa chọn để sàng lọc các khuẩn lạc đột biến.
Sàng lọc các khuẩn lạc B. subtilis B5kháng rifampicin
Với chủng B. subtilis B5 khi đƣa các khuẩn lạc KKS-0,2 lên môi trƣờng NA có bổ sung rifampicin 2 µg/ml thu đƣợc duy nhất 2 khuẩn lạc (xuất phát từ chủng B5 chiếu xạ liều 2000) có vòng phân giải casein lớn hơn chủng thuần (gọi là khuẩn lạc KKS-2). Hai khuẩn lạc này tiếp tục đƣợc cấy lên đĩa NA bổ sung rifampicin nồng độ 4 µg/ml, kết quả chỉ một đĩa duy nhất xuất hiện 7 khuẩn lạc. Sau 3 ngày nuôi cấy, kiểm tra khả năng sinh protease của cả 7 khuẩn lạc kháng KS 4 µg/ml này thì chúng tôi thu đƣợc duy nhất một khuẩn lạc (ký hiệu là: 1909) có vòng phân giải casein lớn hơn chủng thuần, khuẩn lạc KKS-0,2 và KKS-2 µg/ml.
Chọn riêng các khuẩn lạc KKS-4 là 1909 và so sánh kích thƣớc vòng phân giải casein của nó với chủng thuần B. subtilis B5 ban đầu và các khuẩn lạc KKS-0,2 và KKS-2 kết quả đƣợc trình bày ở Hình 3.12
Hình 3.12. Kích thƣớc vòng phân giải casein của chủng Bacillus subtilis B5 thuần và của các khuẩn lạc kháng rifampicin
Tiếp tục đƣa khuẩn lạc 1909 này lên MT bổ sung rifampicin 6 µg/ml để tăng khả năng sàng lọc khuẩn lạc KKS có khả năng sản xuất protease lớn tuy nhiên không có bất kỳ một khuẩn lạc nào mọc sau 7 ngày nuôi cấy.
Sàng lọc các khuẩn lạc B. subtilis H12kháng rifampicin
Mƣời bốn khuẩn lạc B. subtilis H12 kháng rifampicin 0,2 µg/ml sau khi cấy
trên đĩa NA có bổ sung rifampicinnồng độ2 µg/ml, lựa chọn các khuẩn lạc có vòng phân giải casein lớn hơn chủng thuần và tiếp tục đƣa chúng lên các nồng độ kháng sinh cao hơn để tăng khả năng sàng lọc khuẩn lạc KKS có khả năng sản xuất protease lớn. Cuối cùng chúng tôi chọn đƣợc 2 khuẩn lạc kháng rifampicin 12 µg/ml (ký hiệu là 1844 và 1847) xuất phát từ chủng H12 chiếu xạ liều 700 Gy có vòng phân giải casein lớn vƣợt trội so với chủng thuần. Ở liều 1000 Gy chọn đƣợc 8 khuẩn lạc có vòng phân giải caseein lớn vƣợt trội ở các nồng độ rifampicin khác nhau ký hiệu là; 1379, 1665, 1670 (kháng rifampicin 8 µg/ml), 19, 1713 (kháng rifampicin 10 µg/ml), 2, 6, 1904 (kháng rifampicin 12 µg/ml).
Chúng tôi đã không thu đƣợc bất kỳ một khuẩn lạc H12 từ các khuẩn lạc tiềm năng nói trên khi cấy chúng lên môi trƣờng NA có bổ sung nồng độ rifampicin cao hơn 12 µg/ml.
(A) (B)
Hình 3.13. Vòng phân giải casein của một số khuẩn lạc B. subtilis H12 kháng xạ và kháng rifampicin (A: Khuẩn lạc kháng rifampicin 12 µg/ml và chiếu xạ liều
700 Gy; B: Khuẩn lạc kháng rifampicin 8 µg/ml và chiếu xạ liều 1000 Gy) Có thể nhận thấy, việc tăng dần áp lực chọn lọc đã tạo ra các khuẩn lạc B. subtilis kháng rifampicin mạnh (kháng rifampicin 12 µg/ml) gấp 60 lần so với nồng
độ thử nghiệm ban đầu (0,2 µg/ml rifampicin).
Nhƣ vậy, sau quá trình xử lý chiếu xạ kết hợp với streptomycin và rifampicin gây đột biến, 17 khuẩn lạc B. subtilis có khả năng sinh protease vƣợt trội so với
đƣợc phân tích và xác định các gen mã cho sản phẩm liên quan tới quá trình sinh tổng hợp protease.
Bảng 3.7. Các khuẩn lạc Bacillus subtilis có khả năng sinh protease vƣợt trội
ST T Chủng gốc Khuẩn lạc B. subtilis sinh protease vƣợt trội Liều chiếu (Gy) Nồng độ KS (µg/ml) Đƣờng kính vòng phân giải casein (mm) Hoạt độ protease (IU/ml) Str* Rif* 1 B.subtilis B5 301 300 200 24,83±1,44 1556,32±51,91 2 321 300 200 26,17±0,89 1684,15±55,10 3 322 300 200 29,33±1,78 1826,42±58,66 4 528 500 200 23,83±1,44 1518,75±59,97 5 533 500 200 27,83±0,78 1735,84±65,40 6 609 500 200 33,50±0,33 2017,54±21,35 7 1909 1000 4 31,66±0,89 1880,45±74,97 8 B5 thuần 18,66±0,89 745,83±19,40 9 B.subtilis H12 2 1000 12 28,17±0,55 1756,73±30,13 10 6 1000 12 30,00±1,67 1864,58±65,29 11 19 1000 10 29,17±1,56 1834,28±29,69 12 1379 1000 8 28,00±1,67 1772,15±78,44 13 1665 1000 8 27,17±1,72 1718,66±63,37 14 1670 1000 8 29,08±1,61 1837,12±65,74 15 1713 1000 10 25,50±1,16 1682,47±61,36 16 1844 700 12 29,00±0,00 1841,27±78,41 17 1847 700 12 28,33±1,44 1738,56±76,43 18 1904 1000 12 27,92±1,11 1731,25±66,29 19 H12 thuần 18,25±0,50 726,67±26,97
*Str - Streptomycin; Rif - Rifampicin