chủng Bacillus subtilis
Các chủng Bacillus subtilis B5, H12 và VI thuần đƣợc nuôi cấy riêng rẽ trên môi trƣờng NB. Quá trình nuôi cấy lắc đƣợc thực hiện ở điều kiện 37 o
C, 120 vòng/phút, dịch nuôi cấy vi khuẩn đƣợc thu sau các thời điểm 2, 4, 6, 8, 12, 24 và 48 giờ. Hoạt tính protease trong dịch ngoại bào của các chủng vi khuẩn tại các thời điểm nuôi cấy khác nhau đƣợc định tính bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch-casein 0,1%. Kết quả đo kích thƣớc vòng phân giải casein đƣợc trình bày trong Hình 3.4.
Hình 3.4. Kích thƣớc vòng phân giải casein bởi protese của các chủng Bacillus subtilis tạo ra tại các thời điểm nuôi cấy khác nhau
Kết quả cho thấy hoạt tính protease do cả 3 chủng B. subtilis tạo ra tăng dần theo
thời gian nuôi cấy và đạt giá trị cao nhất vào thời điểm 8 giờ. Hoạt tính giảm không đáng kể và tƣơng đối ổn định từ 10-24 giờ, sau thời điểm này hoạt tính có xu hƣớng giảm nhẹ đến 48 giờ. Nhƣ vậy, hoạt độ protease lớn nhất tƣơng đối đồng nhất với giá trị OD550 cao nhất đo đƣợc của dịch nuôi cấy tại thời điểm 8 giờ tức là lúc mật độ tế bào lớn nhất (số liệu không đƣợc trình bày ở đây). Mặc dù vậy do hoạt tính enzym giảm không đáng kể và ổn định trong suốt khoảng thời gian từ 10-24 giờ, nên đây là thời điểm thuận lợi để thu dịch và kiểm tra hoạt tính protease.
A B
Hình 3.5. Hoạt tính protease của các chủng B. subtilis đƣợc kiểm tra ngay sau
khi thu (A) và sau bảo quản 48 giờ (B)
Trong đó, số 1, 2 và 3 là dịch ngoại bào thu sau 24h nuôi cấy, số 1’,2’ và 3’là dịch ngoại bào thu sau 48 giờ nuôi cấy
Bên cạnh việc kiểm tra hoạt tính protease tại các thời điểm khác nhau thì ảnh hƣởng của thời gian bảo quản tới hoạt tính dịch enzym ngoại bào cũng đƣợc đánh giá. Protease của dịch ngoại bào đƣợc thu tại hai thời điểm (24 và 48 giờ) ngay lập tức đƣợc xác định định định tính bằng phƣơng pháp khuếch tán hoặc bảo quản 4
o
C trong 48 giờ rồi mới đem kiểm tra. Kết quả thí nghiệm trong Hình 3.5-A cho thấy không có sự khác nhau đáng kể về hoạt tính protease của dịch ngoại bào thu tại thời điểm sau 24 và 48 giờ nuôi cấy. Tuy nhiên, thời gian bảo quản dịch ngoại bào
ảnh hƣởng đáng kể tới hoạt tính protease của các chủng, hoạt tính bị giảm rõ rệt sau khi dịch đƣợc bảo quản lạnh 4 oC, 48 giờ (Hình 3.5-B)
Nhƣ vậy, để thuận tiện và giảm thiểu mức độ suy giảm hoạt tính protease, thời gian nuôi cấy 24 giờ và kiểm tra hoạt tính enzyme ngay sau khi thu dịch nuôi sẽ đƣợc lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.