Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.4. Phương pháp phân lập vi khuẩn Salmonella ISO 6579-2003
a. Phương pháp nuôi cấy phân lập vi khuẩn Salmonella theo ISO 6579-2003
Bước 1: Tăng sinh không chọn lọc.
(i) Lấy 25g mẫu thịt lợn, gà cắt nhỏ bằng kéo vô trùng và cho vào túi dập
mẫu, (ii) Cho dung dịch đệm Buffer Pepton water theo tỉ lệ 1/10 (225ml PBW),
(iii) Đồng nhất mẫu với môi trường bằng máy dập mẫu (Stomacher) trong 1 phút
với tốc độ 230 vòng/ phút, (iiii) Nuôi cấy trong tủ ấm 37oC/ 16-18h.
Bước 2: Tăng sinh chọn lọc.
(1) Dùng pipet vô trùng hút 1-1.2ml dung dịch tăng sinh không chọn lọc, nhỏ 3giọt (0.1ml) vào thạch bán cố thể MSRV, (2) Nuôi cấy trong tủ ấm 41.50C/24-48h, (3) Phần còn lại cho vào ống nghiệm có chứa 9ml môi trường Muller Kauffmann, (4) Dùng máy (voltex) lắc đều, để vào tủ ấm 370C/18-24h,
(5) Đọc kết quả: trên môi trường MSRV vi khuẩn mọc lan ra xung quanh giọt canh khuẩn. Ở môi trường Muller Kauffmann hỗn dịch có thể biến đổi màu sắc.
Bước 3: Phân lập trên các môi trưòng chọn lọc
Môi trường Rambach (1) Dùng que cấy có đường kính 1μm lấy 1 vòng
canh trùng từ môi trường MSRV (lấy ở vị trí vi khuẩn lan xa nhất) ria cấy sang đĩa thạch Rambach, (2) Để tủ ấm 370C/18 - 24h, (3) Đọc kết quả: khuẩn lạc dạng S, tròn, rìa gọn và có màu đỏ hoặc hồng cánh sen.
Môi trường XLT4 (1) Dùng que cấy có đường kính 10μm lấy 1 vòng canh trùng từ ống tăng sinh Muller Kauffmann (trước khi lấy phải dùng máy lắc đều hỗn dịch trong ống) ria cấy sang đĩa thạch XLT4, cấy làm 3 đường cấy và thưa dần để tách khuẩn lạc riêng rẽ, (2) Để tủ ấm 370C/18 - 24h, (3) Đọc kết quả: khuẩn lạc dạng S, hơi vồng và có màu đen.
Bước 4: Kiểm tra tính chất sinh hóa
- Từ môi trường XLT4 và môi trường Rambach chọn ra khuẩn lạc điển hình kiểm tra đặc tính sinh hoá trên môi trường Kligler, ria cấy trên bề mặt thạch nghiêng và cấy chích sâu ở phần thạch đứng xuống tận đáy ống nghiệm, để tủ ấm 37oC/18-24h, sau đó đọc kết quả:
+ Nếu phần thạch nghiêng có màu hồng: Lactose âm tính. + Nếu phần thạch đứng có màu vàng: Glucose dương tính. + Nếu có bọt khí: sinh hơi dương tính.
+ Nếu dọc đường cấy trích sâu có màu đen: H2S dương tính.
- Những mẫu có phản ứng đặc trưng của vi khuẩn Salmonella trên môi trường Kligler (Lên men đường glucose, không lên men đường lactose, sinh hơi, H2S dương tính) được cấy kiểm tra vào: Urease, LDC (nuôi cấy yếm khí) và Simmoncitrate, để tủ ấm 37oC/18-24h đọc kết quả:
+ LDC: dung dịch từ màu tím chuyển sang màu vàng, lysine âm tính. + Simoncitrate: phần thạch nghiêng chuyển từ màu xanh lá cây sang màu xanh nước biển.
+ Ure: dung dịch có màu đỏ nhạt chuyển sang mầu hồng rất đậm.
Vi khuẩn Salmonella có các đặc tính sau (phản ứng dướng tính (+)/âm tính (-)): Lysin (+); Urea (-); Lactose (-); Glucose (+); H2S (+); Gas (+).
b. Phương pháp thử phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh Poly OH
- Dùng phiến kính thủy tinh vô trùng, nhỏ 1 giọt dung dịch kháng huyết thanh Poly OH trên phiến kính;
- Dùng que cấy nhựa vô trùng lấy 1- 2 khuẩn lac nghi ngờ Salmonella trên đĩa thạch. Hòa tan khuẩn lạc với kháng huyết thanh;
- Phản ứng dương tính khi quan sát được các hạt nhỏ lợn cợn trên mặt phiến kính;
- Phản ứng âm tính khi dung dịch đồng nhất, không có các hạt nhỏ.
c. Phương pháp giữ giống vi khuẩn
Các mẫu kiểm tra dương tính Salmonella spp. sau khi thử các phản ứng sinh hóa, trên môi trường Kligler agar chọn khuẩn lạc nuôi cấy thuần lại trên đĩa thạch dinh dưỡng Nutrient Agar.
Dùng que cấy vô trùng lấy một lượng khuẩn lạc trên môi trường Nutrient Agar cho vào ống Eppendorf có chứa môi trường glycerol 10% (giữ giống trong tủ -30 °C) và ống Eppendorf có chứa thạch mềm giữ giống (nuôi ở tủ ấm 37 ºC/2h sau đó cất trong tủ mát 3-5 ºC).