3.5.1. Phương pháp lấy mẫu
- Số lượng mẫu lấy theo công thức dịch tễ học (Nguyễn Như Thanh và cs., 2001).
n = (1,96) 2x p x (1-p) d2 Trong đó: p: Tỷ lệ ước đoán d: Sai số = 0,05 1,96 tương ứng với độ chính xác là 95%
Trong nghiên cứu của mình, chúng tôi sử dụng tỷ lệ ước đoán dựa vào kết quả nghiên cứu của tác giả Lê Thị Tuyết năm 2005 tại Thái Bình, theo đó tỷ lệ rau nhiễm mầm bệnh ký sinh trùng (KST) là 50%. Áp dụng vào công thức trên cỡ mẫu cần lấy tối thiểu là 384 mẫu, làm tròn là 390. Chia đều cho 5 loại rau nghiên cứu thì mỗi loại rau cần lấy tối thiểu 78 mẫu. Như vậy mỗi loại rau sẽ lấy ít nhất 13 mẫu ở vùng trồng rau và 13 mẫu ở các chợ ở mỗi địa điểm nghiên cứu.
- Cách lấy mẫu:
+ Tại vùng trồng rau: Mỗi mẫu lấy 500gam rau đến ngày thu hoạch, lấy vào buổi sáng, lấy ở nhiều vị trí khác nhau cho đủ khối lượng cần thiết. Mỗi mẫu rau được đựng trong túi nilon có dán nhãn ghi các thông tin: ngày lấy, nơi lấy, đặc điểm của khu vực lấy mẫu, và được xét nghiệm trong vòng 24 giờ sau khi lấy mẫu. + Tại chợ buôn bán: Chọn mua rau ở các hàng khác nhau, mỗi mẫu rau cũng mua 500 gam và đựng trong túi nilon có ghi các thông tin và tiến hành tương tự như ở vùng trồng rau
3.5.2. Phương pháp xét nghiệm tìm mầm bệnh ký sinh trùng trên mẫu rau
- Xét nghiệm rau tìm trứng giun của các loại chủ yếu truyền lây giữa động vật và người qua rau sống (giun đũa chó, giun đũa lợn, giun móc chó mèo bằng phương pháp rửa rau và ly tâm nước rửa (Đặng Văn Ngữ, 1992) kết hợp với và phương pháp Darling (Phan Lục và Lê Thị Tuyết Minh, 1999).
Mẫu rau sau khi lấy về, nhặt sạch sẽ, bỏ phần già và úa, rửa từng lá, cọng rau dưới vòi nước chảy, thu nước của từng lần rửa (4 lần), để riêng, lọc qua vải màn 2 lớp, để lắng 4 giờ. Gạn bỏ phần nước trong, lấy cặn ly tâm bằng máy ly tâm quay tay trong 2 phút. Gạn bỏ bớt nước trong ống nghiệm từ máy ly tâm, dùng đũa thủy tinh quấy đều phần nước cặn rồi đổ hết vào đĩa Petri. Dùng công tơ hút hút lượng nước rửa vừa phải đưa lên lam kính, soi trên kính hiển vi.
- Nhận biết trứng giun qua đặc điểm hình thái, cấu tạo và màu sắc của trứng, dựa vào nguồn tài liệu của các tác giả: Trịnh Văn Thịnh, 1963; Đỗ Dương Thái, Trịnh Văn Thịnh, 1978.
+ Trứng giun đũa người (Ascaris lumbricoides): Trứng giun đũa đã thụ tinh có hình tròn hoặc bầu dục, kích thước 40- 50 x 50- 75 mm. Màu vàng sẫm hoặc vàng nhạt. Vỏ dày, có 4 lớp, lớp ngoài cùng là tầng vỏ albumin xù xì, có thể gặp trứng giun đũa bị mất vỏ albumin, chỉ còn lớp vỏ dày nhẵn. Nhân: Khi mới bài xuất là một khối tròn sẫm màu..
+ Trứng giun đũa lợn (Ascaris suum) Trứng hình ô van, mầu vàng cánh dán, có 4 lớp vỏ dầy, lớp ngoài gợn sóng. Kích thước: 0,087 x 0,067mm. lớp ngoài cùng là tầng vỏ albumin xù xì, có thể gặp trứng giun đũa bị mất vỏ albumin, chỉ còn lớp vỏ dày nhẵn. Nhân trứng khi mới bài xuất là một khối tròn sẫm màu.
+ Trứng giun đũa chó Toxocara canis
Trứng hình gần tròn, mầu vàng, vỏ dầy, dài 80µm, rộng 70µm. Lớp vỏ ngoài cùng lỗ trỗ như tổ ong.
+ Trứng giun móc chó (Ancylostomacaninum): Hình bầu dục, dài 60 µ, rộng 40µ, vỏ mỏng, màu xám trong, nhân đã phân chia 4- 8 nhân, sau 24- 48 giờ có hình ảnh ấu trùng.
+ Ấu trùng giun móc (Ancylostomacaninum):
* Ấu trùng L1 hình gậy, vỏ mỏng, thực quản hình ụ phình ở đáy, dài 0,17mm.
* Ấu trùng L2 hình gậy, vỏ dầy, mầu xám thực quản hình trụ, dài 0,31mm. * Ấu trùng L3 hình gậy, vỏ dầy mầu xám đậm, thực quản hình trụ, dài 0,59mm.
- Xét nghiệm rau tìm ấu trùng sán lá gan lớn và sán lá ruột lớn bằng phương pháp nạo vét bề mặt thân và cọng rau trong nước, ly tâm nước rửa rau, tìm ấu trùng.
- Nhận biết ấu trùng sán lá gan lớn và sán lá ruột lớn qua hình thái cấu tạo của ấu trùng, dựa vào nguồn tài liệu của tác giả: Đỗ Dương Thái, Trịnh Văn Thịnh, 1978; Nguyễn Văn Thọ, 2006.
+ Sán lá gan lớn (Fasciola hepatica): Trứng sán lá gan lớn có hình bầu dục, mầu vàng sẫm, kích thước 140 x 80µm. Trứng xuống nước, nở ra ấu trùng
lông và ký sinh trong ốc, phát triển thành ấu trùng đuôi, ấu trùng đuôi rời khỏi ốc và bám vào các loại rau mọc dưới nước tạo nang trùng hoặc trôi trong nước.
+ Sán lá ruột (Fasciolopsis buski): Trứng sán lá ruột có kích thước lớn nhất trong các loại trứng giun sán ký sinh ở lợn. Trứng có chiều dài 125 – 140 μm, chiều ngang 75 – 90 μm, màu vàng sẫm. Trong giai đoạn phát triển ở ốc, từ trứng sẽ phát triển thành nhiều ấu trùng đuôi. Nang ấu trùng của sán lá ruột có đường kính từ 120 – 135 μm.
Hình 3.1. Trứng giun đũa lợn có chứa nhân
Nguồn: Internet
Hình 3.2. Ấu trùng giun đũa lợn có khả năng gây bệnh
Hình 3.3. Trứng giun móc chó (độ phóng đại 100 lần)
Nguồn: Internet
Hình 3.4. Trứng sán lá Fasciola
Nguồn: Internet
3.5.3. Phương pháp xác định cường độ nhiễm mầm bệnh ký sinh trùng trên rau xanh rau xanh
- Đánh giá cường độ nhiễm trứng, ấu trùng giun trên 100g rau:
Cân 100 g rau đã nhặt sạch sẽ, rửa từng cọng, lá rau dưới vòi nước chảy, thu nước rửa, lọc qua vải màn 2 lớp, để lắng 4 giờ. Gạn bỏ phần nước trong, lấy cặn ly tâm bằng máy ly tâm quay tay trong 2 phút. Gạn bỏ bớt nước trong trong
ống nghiệm từ máy ly tâm, dùng đũa thủy tinh quấy đều phần nước cặn rồi đổ hết vào đĩa Petri. Dùng công tơ hút hút lượng nước rửa vừa phải đưa lên lam kính, soi trên kính hiển vi, tìm và đếm số trứng từng loại trên tất cả các vi trường. Làm đến khi hết nước rửa.
3.5.4. Phương pháp thử nghiệm các biện pháp diệt mầm bệnh ký sinh trùng trên rau xanh trên rau xanh
- Thu thập trứng giun bằng phương pháp ngâm, rửa rau trong các dung dịch hóa chất. Phân ly trứng giun và ấu trùng giun bằng phương pháp ly tâm tìm trứng và ấu trùng giun.
+ Đánh giá sức sống của trứng giun đũa qua phương pháp nuôi trứng trong nước sinh lý, xác định tỷ lệ trứng không phát triển thành trứng có ấu trùng.
* Bố trí thí nghiệm
- Địa điểm và số lượng mẫu thu thập + Địa điểm thu mẫu rau
Bảng 3.1. Địa điểm thu mẫu rau
TT Tên vùng trồng rau/chợ Địa điểm
1 Hợp tác xã dịch vụ Đức Huy Xã Nhân Nghĩa, huyện Lý Nhân 2 C.ty Trách nhiệm Hữu hạn đầu tư Sản
xuất Phát triển nông nghiệpVinEco
Xã Xuân Khê, huyện Lý Nhân 3 Hộ trồng rau Nguyễn Văn Tín Xã Văn Lý huyện Lý nhân
4 Chợ Vĩnh Trụ Thị trấn Vĩnh Trụ, huyện Lý Nhân
5 Chợ Mạc Hạ Xã Công Lý, huyện Lý Nhân
6 Chợ Chanh Xã Chân Lý, huyện Lý Nhân
7 Hợp tác xã nông nghiệp Cát Lại Xã Ngô Khê, huyện Bình Lục 8 Hộ trồng rau Đặng Xuân Thế Xã Mỹ thọ, huyện Bình Lục
9 Chợ Vọc Xã Vũ Bản, huyện Bình Lục
10 Chợ Bình Mỹ Xã Bình Mỹ, huyện Bình Lục
11 Chợ Song Xã Ngô Khê, huyện Bình Lục
12 Hợp tác xã nông sản hữu cơ Phù Vân Xã Phù Vân, tp. Phủ Lý 13 Hộ trồng rau Nguyễn Văn Sơn Xã Phù Vân, tp. Phủ Lý
14 Chợ Bầu P. Lương Khánh Thiện, tp. Phủ Lý
15 Chợ Châu Sơn P. Lê Hồng Phong, tp. Phủ Lý 16 Công ty thực phẩm sạch GreenFood Đ. Lê Công Thanh, tp. Phủ Lý
+ Số lượng và chủng loại rau thu thập
Trong thời gian nghiên cứu, tại 7 vùng trồng rau và 9 chợ thuộc 2 huyện và 1 thành phố của tỉnh Hà Nam, chúng tôi đã tiến hành thu thập được 390 mẫu rau các loại, trong đó mỗi loại rau thu thập là 78 mẫu đều cho cả vùng trồng rau và chợ.
Bảng 3.2. Tổng hợp số lượng và chủng loại mẫu rau thu thập
Loại mẫu
Địa điểm và số lượng mẫu thu thập
Tổng mẫu
Huyện Lý Nhân Huyện Bình Lục Tp. Phủ Lý
Vùng trồng rau Chợ Vùng trồng rau Chợ Vùng trồng rau Chợ Rau muống 13 13 13 13 13 13 78 Rau cải 13 13 13 13 13 13 78 Rau cần 13 13 13 13 13 13 78 Rau xà lách 13 13 13 13 13 13 78 Cải xoong 13 13 13 13 13 13 78 Tổng mẫu 65 65 65 65 65 65 390
* Xử lý rau với 4 phương pháp
- Tương ứng với mỗi hóa chất thử nghiệm, dùng 4 chậu nhựa có đường kính 25cm, sâu 15cm. Mỗi chậu dùng cho thí nghiệm 1 nồng độ hóa chất thử nghiệm.
- Trứng thu được sau khi ngâm trong hóa chất với các nồng độ và thời gian khác nhau khác nhau được thu thập qua ly tâm và nuôi trong nước sinh lý để theo dõi sự phát triển của trứng tới giai đoạn ấu trùng.
- Rau rửa qua vòi nước vào một chậu nhựa mỗi lần đều thu thập trứng qua ly tâm nước.
- Đưa 1,5lit nước máy vào soong inox, đun sôi nước rội nhúng rau. Để nguội nước ly tâm lấy căn tìm trứng quan sát dưới kính hiển vi và nuôi trứng tìm hiểu sự phát triển của phôi trứng. Tìm hiểu sự tác động của nhiệt tới độ tươi của rau.
+ Ngâm, rửa rau trong nước muối ở các nồng độ 2%, 5%, 10%;
+ Ngâm, rửa rau trong thuốc tím KMnO4 ở các nồng độ 0,1%, 0,3% và 0,5% theo các mốc thời gian 5 phút, 15 phút và 30 phút;
+ Rửa rau dưới vòi nước chảy nhiều lần + Nhúng rau trong nước nóng.
- Chỉ tiêu theo dõi:
+ Sự ảnh hưởng của hoá chất ở các nồng độ khác nhau tới sự phát triển của trứng giun.
+ Sự tác động của hoá chất tới sự phát triển của trứng giun ở các mốc thời gian khác nhau.
+ Nuôi trứng giun đũa trong nước sinh lý 20 ngày để xác định khả năng diệt trứng của các hoá chất.
+ Quan sát và nhận xét sự phát triển của tế bào phôi trứng + Độ sạch của trứng sau khi rửa rau nhiều lần
+ Sức sống của trứng giun, ấu trùng sán sau khi nhúng vòa nước sôi: 100 0C.
3.5.5. Xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học bằng chương trình Excel.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. TỶ LỆ NHIỄM MẦM BỆNH KÝ SINH TRÙNG TRÊN TỪNG LOẠI RAU TRỒNG TRÊN CẠN RAU TRỒNG TRÊN CẠN
4.1.1. Tỷ lệ nhiễm mầm bệnh ký sinh trùng trên từng loại rau ở vùng nghiên cứu nghiên cứu
Với các mẫu rau thu thập được, chúng tôi tiến hành kiểm tra, tìm mầm bệnh ký sinh trùng theo phương pháp đã trình bày ở trên. Kết quả kiểm tra mầm bệnh ký sinh trùng trên các loại rau ở từng vùng nghiên cứu được thể hiện ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Tỷ lệ nhiễm trứng và ấu trùng ký sinh trùng trên từng loại rau ở vùng nghiên cứu
Loại rau
Địa điểm thu thập
Tính chung Vùng trồng rau Chợ Số mẫu kiểm tra Số mẫu (+) Tỷ lệ (%) Số mẫu kiểm tra Số mẫu (+) Tỷ lệ (%) Tổng Số mẫu kiểm tra Số mẫu (+) Tỷ lệ (%) Rau muống nước 39 24 61,53 39 23 58,97 78 47 60,25 Rau cải 39 17 43,58 39 18 46,15 78 35 44,87 Rau cần 39 22 56,00 39 21 53,84 78 43 55,12 Xà lách 39 25 64,10 39 23 58,97 78 48 61,53 Cải xoong 39 22 56,41 39 19 48,71 78 41 52,56 Tổng 195 110 56,41 195 104 53,33 390 214 54,87
Qua bảng 4.1 cho thấy:
Rau xanh ở tỉnh Hà Nam nhiễm ký sinh trùng với tỷ lệ cao, tính chung cho cả vùng trồng rau và các chợ là 54,87%.
Trong đó, rau xà lách nhiễm ký sinh trùng với tỷ lệ cao nhất (61,53%), tiếp đến là rau muống nước (60,25%), thấp nhất là rau cải (44,87%).
Trong tổng số 390 mẫu rau các loại thu thập được, có 110/195 mẫu rau thu thập ở các vùng trồng rau có nhiễm ký sinh trùng, chiếm tỷ lệ 56,41%; tỷ lệ này với các mẫu rau thu thập từ các chợ bán lẻ là 53,33%.
Theo báo cáo của Đinh Thị Thanh Mai (2011) khi nghiên cứu 758 mẫu rau ở Hà Nội và Hải Phòng, tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng trên rau là 90,76%. Kết quả nghiên cứu của Trần Thị Hồng (2007) khi khảo sát ký sinh trùng trên rau sống bán tại các siêu thị trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh, tỷ lệ nhiễm chung là 94,4%. Cùng địa điểm và thời gian trên nhưng khi khảo sát ký sinh trùng trên rau sống bán tại 13 chợ thì Lê Thị Ngọc Kim và cs. cho biết tỷ lệ nhiễm chung là 97,1%. Nguyễn Khắc Lực và cs. tiến hành nghiên cứu mẫu rau quả tại 8 xã thuộc 4 huyện của Hà Nội năm 2009 với 674 mẫu, tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng 83,53% (có 86,50% mẫu rau; 59,46% mẫu quả). Hương Huế và cs. nghiên cứu 300 mẫu rau từ chợ Phúc Yên (Vĩnh Yên) từ năm 2008 đến năm 2009, tỷ lệ nhiễm trứng giun sán 79,3%. So với kết quả của những tác giả trên, có thể thấy kết quả của chúng tôi thấp hơn, lý giải vấn đề này có thể nhận định do trong những năm gần đây tại tỉnh Hà Nam nói riêng và cả nước nói chung phong trào trồng rau theo hướng an toàn, hữu cơ ngày càng phát triển, việc sử dụng hạt giống, đất trồng, nước tưới trong canh tác ngày càng được chucó thể thấy kết quả của chúng tôi thấp hơn, lý giải vấn đề này có thể nhận định do trong những năm gần đây tại tỉnh Hà Nam nói riêng và cả nước nói chung phong trào trồng rau theo hướng an toàn, hữu cơ ngày càng phát triển, việc sử dụng hạt giống, đất trồng, nước tưới trong canh tác ngày càng được chú trọng.
N.Gupta et al. (2009), nghiên cứu tại Titagarh của Ấn Độ, xét nghiệm 172 mẫu rau được trồng ở vùng nước thải (gồm rau diếp, rau cải, cần tây, rau bina, rau mùi tây) tỷ lệ nhiễm trứng giun đường ruột ở rau salat là 44,2%. Theo kết quả nghiên cứu của A. Daryani et al. khảo sát rau xanh tại vùng Ardabil ở Iran (2008), 50% rau ở chợ và 71% rau thu thập tại vườn đã nhiễm ký sinh trùng, thấp hơn kết quả của chúng tôi.
So sánh với kết quả của Esma Koran (2003), nghiên cứu 609 mẫu rau ăn salat được mua tại các chợ bán buôn vào mùa hè (gồm 203 mẫu chưa rửa và 409 mẫu đã rửa sạch: Rau diếp, rau cải đỏ, hành tươi, cà rốt, cà chua, mùi tây, cải lông và hồ tiêu) tại vùng Ankara, Thổ Nhĩ Kỳ tỷ lệ nhiễm chung 5,9%, tỷ lệ nhiễm trứng sán dây là 3,5% thấp hơn nhiều kết quả nghiên cứu của chúng tôi. Như vậy, có thể thấy, kết quả nghiên cứu tỷ lệ nhiễm mầm bệnh ký sinh trùng trên rau của chúng tôi có sự sai khác đáng kể so với các kết quả nghiên cứu tại một số quốc gia trong khu vực và trên thế giới, nguyên nhân của sự sai khác này có thể do điều kiện khí hậu, vệ sinh môi trường, tập quán canh tác khác nhau
giữa các quốc gia và vùng lãnh thổ.
Mặt khác, so sánh tỷ lệ nhiễm mầm bệnh ký sinh trùng giữa vùng trồng rau và chợ, chúng tôi nhận thấy rau ở vùng trồng có tỷ lệ nhiễm từ 43,58% đến 64,1%, trung bình 56,41%. Thu thập tại các chợ rau sống nhiễm ký sinh trùng với tỷ lệ 53,33%. Kết quả thấp hơn kết quả của Đinh Thị Thanh Mai (2011) tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng trên rau ở vùng trồng rau và nơi tiêu thụ lần lượt là 97,14% và 84,18%. Tác giả Amal Khalifa et al. nghiên cứu các loại rau salat bán tại chợ bán buôn bán lẻ ở thành phố Tripoli - Lybya (2009) cho thấy 126 mẫu salat mua tại chợ, tỷ lệ nhiễm chung là 58%, tương đương kết quả của chúng tôi.
Xét trên từng loại rau, tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng cao nhất ở rau xà lách