3.3.1. Đối tượng nghiên cứu
- Côn trùng gây hại trong kho bảo quản nguyên liệu thức ăn chăn nuôi. - Mọt khuẩn đen A. diaperinus.
3.3.2. Dụng cụ nghiên cứu
- Bộ rây sàng côn trùng (đường kính mắt sàng từ 1 – 2,5 mm). - Xiên lấy mẫu đối với hàng bảo quản đóng bao.
- Lọ đựng côn trùng thu thập có nắp lưới thông thoáng. - Khay phân tích mẫu.
- Bình nhựa có vòi, pipet nhựa, găng tay.
- Panh, ống nghiệm, bút lông, kim côn trùng, lam, la men, cốc đong, đĩa petri, hộp nhựa,…
- Kính lúp soi nổi (có bộ phận chụp ảnh) quan sát các đặc điểm hình thái, có thước đo kích thước côn trùng.
- Tủ định ôn theo dõi thí nghiệm côn trùng. - Tủ sấy thức ăn nuôi côn trùng.
- Bàn gia nhiệt để sấy khô tiêu bản lam.
- Hóa chất: Cồn tuyệt đối, glycerol, nước cất, KOH tinh thể, Chloral hydrate, gum arabic.
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
1. Điều tra xác định thành phần côn trùng gây hại trên một số loại nông sản làm nguyên liệu thức ăn chăn nuôi bảo quản trong kho qua các tháng ở khu vực Hải Phòng.
2. Điều tra tình hình gây hại và diễn biến mật độ của mọt khuẩn đen A. diaperinus trên một số loại nông sản làm nguyên liệu thức ăn chăn nuôi bảo quản trong kho.
3. Xác định đặc điểm hình thái, sinh học của mọt khuẩn đen A. diaperinus.
4. Thử nghiệm phòng trừ mọt khuẩn đen A. diaperinus gây hại trên nông sản làm nguyên liệu thức ăn chăn nuôi bảo quản trong kho bằng thuốc xông hơi phosphine.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp điều tra thành phần côn trùng hại kho bảo quản nguyên liệu thức ăn chăn nuôi liệu thức ăn chăn nuôi
* Phương pháp điều tra, lấy mẫu: Áp dụng theo QCVN 01 - 141: 2013/BNNPTNT Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp lấy mẫu kiểm dịch thực vật (chi tiết ở phụ lục 1).
- Thời gian điều tra: từ tháng 1/2017 đến tháng 6/2017, định kỳ điều tra vào ngày 01 và 15 hàng tháng.
- Điều tra trong kho có các hình thức bảo quản khác nhau:
+ Hàng đổ rời: Kho được chia thành nhiều ngăn bằng các cột bê tông xếp xít nhau hoặc bằng các tấm thép cao từ 2 – 3 mét. Nguyên liệu được phân loại rồi được băng truyền đổ rời vào các khoang đó.
+ Hàng đóng bao PP: Loại bao truyền thống, kích cỡ 38 x 55 cm.
+ Hàng đóng bao jumbo: Loại bao hình trụ vuông có quai, kích cỡ 90 x 90 x 120 cm.
Hàng đổ rời
Hàng đóng bao PP Hàng đóng bao jumbo
Hình 3.1. Các loại hình bảo quản nguyên liệu thức ăn chăn nuôi
Định loại côn trùng gây hại theo tài liệu (Bùi Công Hiển, 1995); (Haines et al., 1991).
Chỉ tiêu theo dõi:
Mức độ phổ biến của đối tượng nghiên cứu:
C = Na x 100
N Trong đó:
- C: mức độ phổ biến loài a - Na: Số lượng mẫu thu có loài a - N: Tổng số mẫu thu
- : Không bắt gặp (C = 0) + : Gặp rất ít (0 < C < 25%) ++ : Gặp ít (25 ≤ C < 50%) +++ : Thường gặp (C = 50-75%) ++++ : Gặp rất nhiều (C > 75%)
3.5.2. Nghiên cứu diễn biến mật độ của mọt khuẩn đen A. diaperinus trong kho bảo quản nguyên liệu thức ăn chăn nuôi kho bảo quản nguyên liệu thức ăn chăn nuôi
Nghiên cứu diễn biến mật độ của mọt khuẩn đen A. diaperinus trên nguyên liệu thức ăn chăn nuôi là bột ngô và bột gạo trong các kho chứa hàng rời của Công ty Cổ phần Việt Pháp sản xuất thức ăn gia súc Proconco.
Kho hàng đổ rời: Kho được chia thành nhiều ngăn bằng các cột bê tông xếp xít nhau hoặc bằng các tấm thép cao từ 2 – 3 mét. Nguyên liệu được phân loại rồi được băng truyền đổ rời vào các khoang đó.
Tại mỗi địa điểm nghiên cứu, chọn 3 ngăn kho và mỗi ngăn kho có tích lượng hàng dự trữ 230 tấn/ngăn kho. Thời gian bảo quản kéo dài 8 tháng. Ở mỗi ngăn kho, chọn 12 điểm thu mẫu ngẫu nhiên theo QCVN 01 - 141: 2013/BNNPTNT Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp lấy mẫu kiểm dịch thực vật. Tại mỗi điểm lấy mẫu, lấy 1 kg hàng hóa ở độ sâu 40-50 cm so với bề mặt khối thóc. Mẫu ở các điểm được tập trung và trộn đều rồi chia thành 4 phần bằng nhau. Lấy ngẫu nhiên 1 phần, tiếp tục trộn đều và chia làm 3 phần bằng nhau, lấy ngẫu nhiên 1 phần (1kg) để phân tích côn trùng. Dùng rây tách côn trùng ra khỏi hàng hóa, đếm và ghi số lượng cá thể mọt khuẩn đen A. diaperinus (pha trưởng thành) ở mỗi ngăn kho tại mỗi kỳ điều tra. Số lượng cá thể trưởng thành được quy thành số con/kg hàng hóa sẽ phản ánh mật độ quần thể của mọt khuẩn đen A. diaperinus tại thời điểm điều tra.
- Thời gian theo dõi từ 01/01/2017 đến 30/6/2017. Định kỳ: 01 tháng/lần (ngày 15 hàng tháng).
- Chỉ tiêu theo dõi: Mật độ mọt (con/kg).
3.5.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái mọt khuẩn đen A. diaperinus3.5.3.1. Phương pháp nuôi nguồn mọt khuẩn đen A. diaperinus 3.5.3.1. Phương pháp nuôi nguồn mọt khuẩn đen A. diaperinus
Thu mọt khuẩn đen A. diaperinus trưởng thành trong quá trình điều tra tại các kho bảo quản nguyên liệu thức ăn chăn nuôi và nuôi trong lọ thủy tinh có đường kính 25cm, cao 20cm bên trong có chứa thức ăn là bột gạo đã được khử trùng và làm sạch (khử trùng ở điều kiện nhiệt độ 60oC trong 2 giờ), đây là nguồn cung cấp mọt cho các thí nghiệm của đề tài.
Hình 3.2. Lọ nuôi nguồn mọt khuẩn đen A. diaperinus
3.5.3.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái mọt khuẩn đen A. diaperinus
Thí nghiệm tại Chi cục Trồng trọt và Bảo vệ thực vật Hải Phòng.
Bố trí 02 hộp nhựa đường kính 20 cm, cao 10 cm đựng tương ứng với 02 loại thức ăn là bột ngô và bột gạo trọng lượng 500 gam đã được làm sạch và khử trùng. Mỗi hộp thả 90 trưởng thành lấy từ trong hộp nuôi nguồn cho giao phối quần thể, theo dõi 02 lần/ngày (8 giờ sáng, 5 giờ chiều) để thu trứng. Mỗi quả trứng được quan sát, mô tả màu sắc, đo kích thước trên kính NIKON SMZ18, sau đó được thu vào các hộp nhựa có đường kính 8 cm, cao 5 cm để tiếp tục nuôi cá thể (n ≥ 30) trên thức ăn là bột ngô và bột gạo, lượng thức ăn 30 gam/hộp với điều kiện nhiệt độ cố định trong tủ định ôn là 25oC và 30oC, ẩm độ không khí được duy trì ở 70%. Tiếp tục quan sát, mô tả màu sắc và đo kích thước của từng pha phát dục (n ≥ 30). Đơn vị đo: mm.
- Pha trứng: đo chiều dài từ mép trên đến mép dưới của trứng theo hướng nhất định, chiều rộng đo phần rộng nhất.
- Pha sâu non: chiều dài, chiều rộng đo ở nơi rộng nhất theo từng tuổi sâu. - Pha nhộng: chiều dài, chiều rộng đo nơi rộng nhất của nhộng.
- Pha trưởng thành: chiều dài đo từ mép trên (điểm cao nhất) của trán đến hết cánh cứng, chiều rộng đo nơi rộng nhất của cơ thể.
Thời điểm đo kích thước các pha ngay sau khi vũ hóa.
Dùng công thức thống kê sinh học để tính kích thước trung bình:
N X
X i
Trong đó:
X : kích thước trung bình của từng pha; Xi: giá trị kích thước cá thể thứ i;
N: số cá thể theo dõi.
- Tính sai số theo công thức:
t: tra bảng Student - Fisher, độ tin cậy P = 95%, độ tự do v = n - 1; δ: độ lệch chuẩn; n: số cá thể theo dõi.
: Độ lệch chuẩn, được tính theo công thức:
1 2 N X Xi
3.5.3.3. Xác định thời gian phát dục các pha và vòng đời của A. diaperinus
Thí nghiệm tại Chi cục Trồng trọt và Bảo vệ thực vật Hải Phòng.
Trong quá trình nghiên cứu đặc điểm hình thái (3.5.3.2.), tiến hành theo dõi thời gian phát dục cá thể côn trùng theo từng pha (trứng, sâu non, nhộng và trưởng thành).
Pha trứng: Tính từ lúc xuất hiện trứng đến khi trứng nở.
n t X
Pha sâu non: Thời gian phát dục của mỗi tuổi được tính từ thời điểm lột xác lần trước đến lần lột xác tiếp theo.
Pha nhộng: Tính từ lúc sâu non tuổi cuối hóa nhộng đến khi nhộng hóa trưởng thành.
Pha trưởng thành: Khi phát hiện nhộng vũ hóa trưởng thành. Chọn 30 cặp đực – cái ghép đôi và nuôi trong hộp petri có thức ăn. Theo dõi đến khi tìm thấy quả trứng đầu tiên và ghi chép ngày phát hiện.
Vòng đời của mọt được tính từ khi trứng nở đến khi mọt trưởng thành đẻ quả trứng đầu tiên.
Thời gian phát dục trung bình của cá thể tính theo công thức:
N n X
X i. i
Trong đó:
Xi: thời gian phát dục của cá thể thứ i;
X : Thời gian phát dục của từng giai đoạn; ni: Số cá thể lột xác trong ngày thứ i; N: Số cá thể theo dõi.
Tính sai số theo công thức:
N t X
X .
Trong đó:
t: Tra bảng Student-Fisher với độ tin cậy p = 95% và độ tự do v = n-1 N: Số cá thể theo dõi.
: Độ lệch chuẩn, được tính theo công thức:
1 2 N X Xi
3.5.3.4. Xác định tỷ lệ chết các pha trước trưởng thành của A. diaperinus
Trong quá trình nghiên cứu đặc điểm hình thái (3.5.3.2.), tiến hành theo dõi số cá thể chết trong quá trình phát dục của từng pha (trứng, sâu non, nhộng). Chỉ tiêu theo dõi:
Tỷ lệ chết của các pha trước trưởng thành (%) =
Tổng số cá thể chết
x 100 Tổng số cá thể
theo dõi
3.5.3.5. Thời gian đẻ trứng và sức đẻ trứng của A. diaperinus
Thí nghiệm ở 2 ngưỡng nhiệt độ 25oC và 30oC, ẩm độ 70% trong tủ định ôn BOD JSBI 150C trên 02 loại thức ăn là bột ngô và bột gạo đã được làm sạch và khử trùng.
Trong quá trình theo dõi thời gian phát dục ở trên (mục 3.5.3.3.), thu trưởng thành (F2) vũ hóa từ nhộng, quan sát trên kính lúp soi nổi để phân biệt con cái và con đực sau đó tiến hành ghép đôi giao phối theo phương pháp cá thể (n ≥ 30) trong các hộp nhựa có đường kính 8 cm, cao 5 cm đựng 50 gam thức ăn. Theo dõi 2 lần/ngày (8h sáng và 5h chiều).
Phân biệt con đực và cái dựa vào cấu tạo hình dạng 2 chiếc gai ở phần cuối đốt chày chân trước. Ở con đực, 2 chiếc gai chụm đầu vào nhau; ở con cái 2 chiếc gai có đầu mọc hướng ra hai phía khác nhau.
Hình 3.3. Hình dạng gai ở đối chày chân trước thể hiện sự khác biệt giới tính
(trái: con đực, phải: con cái)
Nguồn:James and Kaufman (2009) Chỉ tiêu theo dõi:
Sức đẻ trứng (quả/trưởng thành cái) = Tổng số trứng đẻ Tổng số trưởng thành cái
Thời gian đẻ trứng
(ngày/trưởng thành cái) =
Tổng thời gian đẻ Tổng số trưởng thành cái
Số trứng đẻ trung bình trong ngày (quả/trưởng thành cái/ngày) =
Tổng số trứng đẻ Tổng thời gian đẻ
Tỷ lệ trứng nở (%) = Tổng số trứng nở x 100 Tổng số trứng
3.5.3.6. Ảnh hưởng mật độ tới sức đẻ trứng của A. diaperinus
Thí nghiệm tại Chi cục Trồng trọt và Bảo vệ thực vật Hải Phòng.
Tiến hành ghép đôi các cặp trưởng thành (đực – cái) mới vũ hóa vào hộp nhựa (đường kính 20 cm, cao 8 cm) đựng 200 gam thức ăn ở mỗi công thức và nuôi trong điều kiện phòng. Thức ăn gồm 2 loại là bột ngô và bộ gạo đã được làm sạch và khử trùng. Thí nghiệm gồm 04 công thức: - CT1: 1 cặp trưởng thành - CT2: 4 cặp trưởng thành - CT3: 7 cặp trưởng thành - CT4: 10 cặp trưởng thành Thí nghiệm nhắc lại 3 lần.
Cặp trưởng thành (đực – cái) mới vũ hóa được lấy như sau: Quan sát tìm nhộng trong hộp nuôi nguồn rồi gắp nhộng ra các đĩa petri. Theo dõi trưởng thành vũ hóa từ nhộng 02 lần/ngày (8h sáng và 5 giờ chiều). Các trưởng thành vũ hóa cùng ngày được quan sát trên kính lúp soi nổi để phân biệt con đực con cái rồi tiến hành cho ghép đôi giao phối. Theo dõi trứng nở 2 lần/ngày (8h sáng và 5 giờ chiều).
Chỉ tiêu theo dõi:
Sức đẻ trứng (quả/trưởng thành cái) = Tổng số trứng đẻ Tổng số trưởng thành cái
Tỷ lệ trứng nở (%) = Tổng số trứng nở x 100 Tổng số trứng
3.5.3.7. Nghiên cứu thời gian sống của trưởng thành A. diaperinus trong điều kiện có và không có thức ăn
Thí nghiệm tại Chi cục Trồng trọt và Bảo vệ thực vật Hải Phòng.
Mỗi công thức thả 5 cặp trưởng thành (đực – cái) mới vũ hóa vào 5 hộp nhựa kích thước đường kính 8cm, cao 5 cm (01 cặp trưởng thành/hộp), nuôi trong điều kiện phòng, lượng thức ăn trong mỗi hộp nếu cho ăn là 30 gam/hộp.
CT1: Không cho ăn CT2: Nuôi trên bột ngô CT3: Nuôi trên bột gạo Thí nghiệm nhắc lại 03 lần.
Theo dõi 02 lần/ngày (8h sáng và 5 giờ chiều), ghi chép số cả thể mọt chết cho đến khi không còn một cá thể nào sống sót.
Chỉ tiêu theo dõi: Thời gian sống ngắn nhất, dài nhất và trung bình của trưởng thành.
3.5.3.8. Xác định khả năng gây hại của loài A. diaperinus trên các loại nông sản khác nhau
Thí nghiệm tại Chi cục Trồng trọt và Bảo vệ thực vật Hải Phòng.
Thí nghiệm tiến hành ở 2 ngưỡng nhiệt độ là 25oC và 30oC, trên 02 loại thức ăn là bột ngô và bột gạo đã được làm sạch và khử trùng.
Bố trí mỗi công thức một hộp đường kính 25cm, cao 20 cm đựng 500 gam thức ăn có thả mọt khuẩn đen A. diaperinus được lấy từ hộp nuôi nguồn. Số lượng trưởng thành thả ban đầu là 15 cặp (đực – cái)/công thức.
Thời điểm kiểm tra thí nghiệm sau 30, 60, 90 và 120 ngày. Tại thời điểm kiểm tra, dùng rây sàng mọt ra khỏi thức ăn để đếm số lượng mọt sống (pha trưởng thành), cân khối lượng thức ăn còn lại ở mỗi công thức. Sau khi kiểm tra, toàn bộ số mọt được đưa trả về hộp ban đầu để kiểm tra ở lần tiếp theo.
Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng mọt (con). Trọng lượng nông sản hao hụt (gam). Tỷ lệ hao hụt nông sản (%). Phương pháp tính thủy phần theo Bùi Công Hiển và cs. (2014).
Tỷ lệ hao hụt nông sản (%) = OW – CW x 100 OW
Trong đó:
OW: khối lượng chất khô của mẫu ban đầu
CW: khối lượng chất khô của mẫu thí nghiệm cuối cùng. Thí nghiệm nhắc lại 03 lần
3.5.4. Thử nghiệm biện pháp phòng trừ mọt khuẩn đen A. diaperinus bằng thuốc xông hơi hoạt chất phosphide (Quickphos 56%) thuốc xông hơi hoạt chất phosphide (Quickphos 56%)
- Địa điểm: Chi cục Trồng trọt và Bảo vệ thực vật Hải Phòng. - Thuốc thí nghiệm: Quickphos 56 %
- Côn trùng thí nghiệm: Trưởng thành mọt khuẩn đen Alphitobius diaperinus (Panzer) vừa mới vũ hóa. Số lượng: 100 trưởng thành/công thức/lần nhắc lại.
- Thiết kế thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 04 công thức, nhắc lại 03 lần, thiết kế theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD).
Công thức Liều lượng
CT 1 1 gam PH3/m3
CT 2 2 gam PH3/m3
CT 3 3 gam PH3/m3
ĐC Không đặt thuốc
Nhiệt độ xông hơi: nhiệt độ phòng, dao động từ từ 20°C đến 30oC. Cách tiến hành thí nghiệm:
Côn trùng thí nghiệm được đặt trong các lọ nhựa đựng 1kg bột ngô. Lọ có đường kính 25 cm, cao 20 cm, có nắp lưới. Xung quanh miệng lọ được bôi một lớp Fluon để ngăn không cho côn trùng bò lên trên. Đưa các lọ nhựa chứa mọt khuẩn đen A. diaperinus vào các thùng gỗ thể tích 1m3 chuyên dụng dùng để xông hơi trong phòng. Đặt thuốc Quickphos 56 % ở liều lượng thí nghiệm vào trong thùng xông hơi rồi dùng giấy Kraft và hồ làm kín thùng xông hơi. Kiểm tra số lượng côn trùng sống sau 1 ngày, 5 ngày, 10 ngày xông hơi.
Sau khi kết thúc thời gian xông hơi, tiến hành mở các thùng gỗ khử trùng để thông thoáng trong thời gian 2 giờ. Sau đó lấy các lọ có chứa mọt khuẩn đen
A. diaperinus thí nghiệm ra và kiểm tra số lượng mọt sống, chết ở các thời điểm kết thúc xông hơi.
Nếu tỷ lệ mọt chết ở các công thức đối chứng ≥ 10% thì phải làm lại thí nghiệm.
- Hiệu lực của thuốc được tính theo công thức Abbott:
Trong đó:
+ H (%) là hiệu lực của thuốc tính theo phần trăm.
+ Ca là số lượng cá thể côn trùng sống ở công thức đối chứng sau xử lý.