Đây là phương pháp chẩn đoán cơ bản có ý nghĩa quyết định.
Để phân lập virus thường sử dụng mẫu bệnh phẩm là phổi, khí quản, não, lách. Bệnh phẩm sau xử lý được tiêm vào phôi gà 9 - 11 ngày tuổi, ấp 37oC trong 7 ngày thì thu hoạch trứng (virus cũng có thể phân lập trên môi trường tế bào).
Sau khi phân lập được virus từ môi trường tế bào hoặc trên phôi trứng thì có thể giám định virus bằng các phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI test) để giám định subtype H và N.
Phương pháp Realtime RT - PCR trực tiếp phát hiện gen của virus cúm A/H5N1, A/H5N6 và H7N9 trong mẫu bệnh phẩm đã được đưa vào ứng dụng cho phép chẩn đoán nhanh, chính xác, với độ tin cậy cao và phân biệt được sự hiện diện của các chủng virus cúm A gây bệnh chỉ với một lượng nhỏ mẫu bệnh phẩm xét nghiệm. Ngoài ra còn có các phương pháp chẩn đoán khác như: kỹ thuật ELISA, kỹ thuật khuếch tán trên thạch...
Phản ứng Real time RT-PCR
Phản ứng Real Time RT - PCR là một kỹ thuật PCR sử dụng các đặc điểm của quá trình sao chép DNA. Real Time RT - PCR cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy DNA khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra. Khả năng này được phát hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang. Hóa
chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệu với primer gọi là probe. Khi DNA tương hợp với primer thì quá trình sao chép sẽ xảy ra và sự gia tăng lượng tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ với sự gia tăng lượng DNA. Khi sử dụng máy Bio - Rad, máy có bộ phận camera có thể chụp được tín hiệu huỳnh quang khi quá trình khuếch đại xảy ra. Ban đầu, tín hiệu huỳnh quang còn ở tín hiệu nền ta không thể phát hiện sự gia tăng tín hiệu cho dù có quá trình khuếch đại và sản phẩm đã tăng theo hàm mũ. Đến một thời điểm xác định, sản phẩm khuếch đại đã tạo ra đủ tín hiệu huỳnh quang có thể phát hiện được. Chu kỳ này được gọi là chu kỳ ngưỡng Ct
(cycle of threshold). Đây là giá trị để đánh giá kết quả phản ứng.
Cúm gia cầm type A có vật chất di truyền là RNA nên trong phản ứng RT - PCR có thêm quá trình sao chép ngược từ RNA→DNA gọi là Reverse Transcription nên phương pháp này được gọi là Real Time RT - PCR.
+ Nguyên lí hoạt động của probe:
Có nhiều loại hóa chất phát huỳnh quang dựa trên primer và probe, hóa chất được sử dụng trong phản ứng Real Time RT - PCR là Taqman probe.
Taqman probe được sử dụng như một trình tự oligonucleotide đặc hiệu, gắn chất huỳnh quang gọi là mẫu dò Taqman probe, cùng với các primer.
Trong giai đoạn kết hợp bắt gặp và kéo dài DNA trong phản ứng khuếch đại, probe liên kết với trình tự đích và hoạt động 5’ - 3’ exonuclease đặc hiệu cho DNA mạch đôi của Taq sẽ cắt đứt đầu gắn chất huỳnh quang. Kết quả chất huỳnh quang bị tách khỏi chất hấp phụ và tín hiệu huỳnh quang phát ra tỷ lệ với lượng sản phẩm khuếch đại trong mẫu.