3.4.1. Phương pháp điều tra hồi cứu
3.4.2. Phương pháp lấy mẫu Phương pháp lấy mẫu Swab Phương pháp lấy mẫu Swab
Lấy 5 mẫu swab đơn từ 5 thủy cầm khác nhau của một hộ buôn bán thủy cầm sống được bảo quản trong 1 ống ly tâm và mỗi ống được coi là 1 mẫu gộp xét nghiệm (Swabs gộp).
+ Ngoáy ổ nhớp: dùng tăm bông vô trùng ngoáy vào sâu trong ổ nhớp gia cầm, cho vào ống chứa dung dịch bảo quản, đậy nắp kín.
+ Ngoáy vùng hầu, khí quản: dùng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vùng hầu, khí quản của gà, vịt, ngan, tăm bông sau khi ngoáy cho vào ống chứa dung dịch bảo quản, đậy nắp kín.
3.4.3. Phương pháp xử lý mẫu
+ Mẫu swab được bảo quản trong ống ly tâm 15ml có dung dịch bảo quản mẫu.
+ Vortex ống mẫu vẫn còn tăm bông bên trong 15 giây.
+ Để nguyên tăm bông trong ống và ly tâm ở 1.000 vòng trong 10 phút. + Thu dịch nổi chuyển sang ống eppendorf vô trùng.
+ Sau khi xử lý mẫu các ống eppendorf được bảo quản ở nhiệt độ bình thường nếu tiến hành chiết tách RNA ngay sau đó. Nếu mẫu không được chiết tách RNA ngay thì sẽ được bảo quản trong tủ âm sâu -800C và trước khi tách mẫu được mang rã đông (chú ý tránh rã đông nhiều lần).
3.4.4. Các bước tiến hành phản ứng Real Time RT – PCR
Sau khi thu mẫu, tiến hành kiểm tra mẫu và để lựa chọn mẫu đạt yêu cầu xét nghiệm; tiến hành xét nghiệm theo quy trình của phương pháp RT- PCR. Các bước tiến hành phản ứng RT – PCR bao gồm:
Chiết tách RNA
Trước khi chiết tách RNA ta cần chuẩn bị: dung dịch đệm RLT bổ sung β - Mecraptoethanol (β - ME) tỷ lệ 1/100 và dung dịch đệm rửa RPE bổ sung 4 lần thể tích ethanol. Mẫu sau khi được xử lí sẽ tiến hành chiết tách. Các bước chiết tách theo hình 3.1.
Bảng 3.1. Primer và probe dùng xác định nhiễm virus cúm A/H5N1, A/H5N6 và A/H7N9
PPP Name (Source) Primer/ Probe Sequence (5' - 3') Modification 5' 3' M-5
Probe 1 TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG FAM BHQ1
Forward 1 GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C None None
Reverse 1 AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT
CTA None None
Probe 2 TCA GGC CCC CTC AAA GCC GA FAM BHQ1
Forward 2 AGA TGA GYC TTC TAA CCG AGG
TCG None None
Reverse 2 TGC AAA NAC ATC YTC AAG TCT CTG None None
H5- 9S
Probe TCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGCA FAM BHQ1
Forward ACATATGACTACCCACARTATTCAG None None
Reverse1 AAACCAGCCACTATGATTGC None None
Reverse2 AGACCAGCTAYCATGATTGC None None
N1-2 (China)
Probe TGGTCTTGGCCAGACGGTGC FAM BHQ1
Forward TGGACTAGTGGGAGCAGCAT None None
Reverse TGTCAATGGTTAAGGGCAACTC None None
N6-1
Probe CCAATAACAGGAGGGAGCCCAGACCC FAM BHQ1
Forward CCCCACCAATGGGAACTG None None
Reverse TCTAGGAATGCAAACCCTTTTACC None None
H7-6 (CODA)
Probe TGGTTTAGCTTCGGGGCATCATG FAM BHQ1
Forward GYAGYGGYTACAAAGATGTG None None
Reverse GAAGACAAGGCCCATTGCAA None None
N9-1 (CNIC)
Probe AGACAATCCCCGACCGAATGAATGAC
CC FAM BHQ1
Forward TAGCAATGACACACACTAGTCAAT None None
Reverse ATTACCTGGATAAGGGTCATTACACT None None
Nguồn: Dự án FAO
Taqman probe gắn một chất phát huỳnh quang ở đầu 5’- và một chất hấp phụ huỳnh quang ở đầu 3’-. Khi còn nguyên vẹn, tín hiệu của chất phát huỳnh quang bị hấp thụ do nó nằm gần chất hấp phụ.
Hình 3.1. Các bước chiết tách RNA bằng Qiagen Rneasy Mini Kit
Giữ RNA ở 40C để xét nghiệm trong vài giờ, lưu giữ ở -200C nếu chưa xét nghiệm ngay trong ngày.
600µl đệm RLT. 200µl mẫu. Vortex trong 1 phút. 400 µl cồn tuyệt đối 100%. Vortex 15 giây, spin nhẹ. Gắn cột lọc và điều chỉnh hệ thống máy hút chân không.
Cho toàn bộ mẫu vào cột lọc.
700µl RW1. Rút hết dung dịch trong cột lọc. 500µl RPE. Rút hết dung dịch trong cột lọc. Lặp lại lần 2. Cho cột lọc vào ống lọc. Ly tâm
1200 vòng/phút trong 2 phút. Lấy cột lọc cho vào ống
eppendorf. 50µl nước Rnase - free. Ly tâm 10000 vòng trong 1 phút. Thu lấy RNA.
Chuẩn bị Master mix
Master mix nhằm trộn lẫn các chất phản ứng cũng như các chất đệm, chất xúc tác cho quá trình sao chép DNA khi có sự tương đồng giữa primer và bộ gen đã chiết tách. Quá trình chuẩn bị master mix được tiến hành trong buồng vô trùng và thực hiện như sau:
Chuẩn bị ống eppendorf, vortex rồi spin các ống nguyên liệu rồi lần lượt cho các chất vào ống eppendorf như bảng 2.2:
Bảng 3.2. Các thành phần trong Master mix
Hóa chất Lượng/1 mẫu (µl)
Nước 10,5 5x Reaction mix 5,0 MgCl2 1,2 dNTP. P.P.P 0,8 P.P.P (mồi) 1,5 Enzyme mix 1,0 Tổng 20
Sau khi cho các chất trên vào ống eppendorf ta tiến hành vortex và spin trong thời gian 10 - 15giây. Các nguyên liệu được sử dụng có trong bộ kit Qiagen. Template mẫu (tra mẫu)
Template là quá trình chuẩn bị các ống mẫu trước khi chạy trên máy RT - PCR. Trước khi template mẫu, chuẩn bị ống PCR tương ứng với số lượng mẫu cần chẩn đoán. Sau đó tiến hành theo các bước sau:
- Cho 20µl hỗn hợp Master mix vào ống PCR.
- Cho 5µl RNA mẫu đã chiết tách được ở trên vào hỗn hợp Master mix của các Tube mẫu.
- Cho 5µl mẫu đối chứng (+) vào hỗn hợp master mix của tube đối chứng dương (postive).
- Cho 5µl nước đã được khử RNase vào hỗn hợp Master mix của Tube đối chứng âm (negative).
Chạy máy Real Time RT – PCR:
Chu trình nhiệt cho phản ứng RT - PCR phát hiện Cúm gia cầm type A/H5N1, H7N9
Bảng 3.3. Bảng chu trình nhiệt cho phản ứng Real Time RT - PCR
RT (bước phiên mã ngược) PCR
500C - 30 phút
40 chu kỳ x (950C - 10 giây + 580C - 50 giây) 950C - 2 phút
Đọc huỳnh quang ở bước Annealing - extension (=600C trong 30 giây).
Đọc kết quả
Kết quả xét nghiệm được công nhận khi:
Đối chứng dương (+) cho giá trị Ct đã biết (±2) Đối chứng âm (-) không có Ct
Mẫu dương tính khi giá trị Ct ≤ 35,0
Mẫu âm tính không cho giá trị Ct
Mẫu nghi ngờ khi giá trị Ct > 35,0
Trình tự các phản ứng Realtime RT-PCR để xác định các gen
Bước 1: Tách ARN với bộ kít Invitrogen (Hilden. Germany) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Bước 2: ARN được khuếch đại với kít Invitrogen nhằm xác định sự có mặt của gen M (matrix gene).
Bước 3: Các mẫu dương tính với gen M được tiếp tục xác định sự có mặt của gen H5 và H7 bởi kít Qiagen
Bước 4: Các mẫu dương tính với gen H5 được xác định sự có mặt của gen N1 và N6, các mẫu dương tính với H7 được tiếp tục xác định sự có mặt của gen N9 bởi kít Invitrogen.
3.4.5. Phương pháp giải trình tự gen
Kiểm tra sản phẩm RT-PCR, tinh sạch và dòng hóa sản phẩm vào vector tách dòng
Sản phẩm RT-PCR được kiểm tra trên agarose 1%, được tinh sạch bằng bộ kit QIAquick Purification kit (QIAGEN Inc.) theo hướng dẫn. Gen HA trong
sản phẩm sau khi tinh sạch được dòng hóa vào vector pCR2.1TOPO (Invitrogen). Các phản ứng nối ghép gen, chuyển nạp plasmid vào tế bào E. coli bằng phương pháp tạo sốc nhiệt được tiến hành theo đúng quy trình. Vi khuẩn tái tổ hợp được chọn lọc nuôi cấy trong môi trường LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 37oC trong 16- 20 giờ. Tế bào được thu lại bằng ly tâm và tách chiết ADN plasmid bằng bộ kit QIApreps Spin Mini kit của hãng QIAGEN.
Giải trình trình tự và phân tích số liệu
Trình tự nucleotide ADN của plasmid được giải trình trên máy tự động ABI-3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Chuỗi nucleotide được xử lý bằng chương trình SeqEd1.03, sau đó sử dụng chương trình AssemLIGN 1.9 và hệ chương trình MacVector 8.2 (Accelrys Inc.) trên máy tính Macintosh. So sánh đối chiếu và xử lý số liệu các chuỗi bằng chương trình GENEDOC 2.5.
Chọn chuỗi so sánh mức độ tương đồng trình tự nucleotide
Chuỗi nucleotide gen H5 của chủng virus cúm A/H5N6 từ tỉnh Nam Định và Lào Cai sẽ được đối chiếu, so sánh với các chủng của Việt Nam đã công bố và chủng của Trung Quốc đã công bố được thu thập từ Ngân hàng gen (GenBank).
3.4.6. Xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học trên chương trình Microsoft Excel.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. TÌNH HÌNH CHĂN NUÔI GIA CẦM, TÌNH HÌNH TIÊM PHÒNG VACXIN VÀ TÌNH HÌNH DỊCH CÚM GIA CẦM TẠI 3 TỈNH/THÀNH VACXIN VÀ TÌNH HÌNH DỊCH CÚM GIA CẦM TẠI 3 TỈNH/THÀNH PHỐ NGHIÊN CỨU
4.1.1. Tình hình chăn nuôi gia cầm
Chăn nuôi gia cầm là một thế mạnh của Việt Nam cũng như các tỉnh miền núi phía Bắc, có tỷ trọng cao trong chăn nuôi (chỉ đứng sau chăn nuôi lợn). Vì vậy, việc phòng chống dịch Cúm gia cầm có hiệu quả sẽ góp phần nâng cao thu nhập cho người chăn nuôi, góp phần thực hiện mục tiêu phát triển kinh tế - xã hội, đưa chăn nuôi trở thành ngành sản xuất chính.
Một trong số các biện pháp phòng chống bệnh Cúm gia cầm có hiệu quả cao, đó là chương trình giám sát chủ động và bị động Cúm gia cầm tại các chợ đầu mối buôn bán gia cầm sống. Với sự hỗ trợ kinh phí từ Tổ chức Nông lương Thế giới (FAO), chương trình giám sát được tiến hành trên cả nước. Hoạt động giám sát lâm sàng, lấy mẫu giám sát chủ động nhằm phát hiện sớm các ổ dịch cúm trên đàn gia cầm để xử lý kịp thời, không để dịch lây lan. Các chợ có mẫu gia cầm dương tính virus cúm type A/H5N1 và A/H5N6 phải được tăng cường công tác kiểm dịch gia cầm và vệ sinh tiêu độc khử trùng hàng ngày.
Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá lưu hành virus Cúm gia cầm trên địa bàn 3 tỉnh/ thành phố: tỉnh Lào Cai, tỉnh Nam Định, thành phố Hà Nội giai đoạn 2015-2016.
Thành phố Hà Nội
Chăn nuôi nhỏ lẻ trong khu dân cư chiếm trên 50%. Thành phố hiện có khoảng 2.147 trại chăn nuôi ngoài khu dân cư và tập trung phát triển chăn nuôi gia cầm ở 29 xã chăn nuôi trọng điểm trên địa bàn 6 huyện. Thành phố Hà Nội có nhiều cơ sở chăn nuôi sản xuất con giống gia cầm, mỗi năm cung cấp 70 - 90 triệu con gia cầm giống, đồng thời nhập từ 10 - 20 triệu quả trứng giống.
Thành phố Hà Nội có nhu cầu tiêu dùng thực phẩm có nguồn gốc từ động vật rất lớn, trung bình 600 - 700 tấn/ngày, trong đó tỷ lệ thịt gia cầm chiếm 45%, trong khi thành phố mới tự cung cấp được 60%, còn lại nhập từ các tỉnh khác hoặc
nhập khẩu; giết mổ gia cầm chủ yếu nhỏ lẻ trong khu dân cư. Thành phố Hà Nội có chợ gia cầm Hà Vỹ (huyện Thường Tín), là nơi tập trung và tiêu thụ một lượng lớn gia cầm, hàng ngày cung cấp số lượng lớn thực phẩm cho cả miền Bắc. Ngoài ra một số chợ lớn có buôn bán gia cầm sống nhằm phục vụ những đại bàn có dân cư đông như chợ Bắc Thăng Long, Chợ Vân Đình, Chợ Bình Đà, Chợ TT Sóc Sơn… Gia cầm ở đây không chỉ có ở chăn nuôi của thành phố, các tỉnh mà còn cả số lượng lớn gia cầm nhập khẩu từ các nước khác, mà chủ yếu là Trung Quốc.
Với các điều kiện thuận lợi cho chăn nuôi, nhu cầu tiêu thụ thực phẩm lớn thì thành phố Hà Nội có tổng đàn gia cầm lớn nhất và tăng dần qua các năm, trong năm 2015 với 16.522.200 con gà, số vịt 5.093.300 con, tổng đàn chung 21.615.500 con. Đến năm 2016, số gà đã tăng rất lớn với khoảng 22.744.300 con, trong đó gà khảng 17.191.000 con, vịt khoảng 5.553.300 con.
Tỉnh Nam Định
Nam Định là một tỉnh nằm ở phía nam đồng bằng Bắc Bộ, Việt Nam. Nam Định tiếp giáp với tỉnh Thái Bình ở phía bắc, tỉnh Ninh Bình ở phía nam, tỉnh Hà Nam ở phía tây bắc, giáp biển (vịnh Bắc Bộ) ở phía đông. Vị trí địa lý rất thuận tiện cho việc phát triển đánh bắt, nuôi trồng thủy sản. Bên cạch đó Nam Định cũng là địa phương có nhiều điều kiện thuận lợi để phát triển chăn nuôi đặc biệt là chăn nuôi gia cầm.
Năm 2015, tổng đàn gia cầm là 7.102.600 con, số gà là 5.267.400 con, số vịt là 1.835.200 con. Đến năm 2016, tổng đàn là 7.512,500 con, số gà 5.580.000 con, số vịt 1932.500 con. Đàn gia cầm trên địa bàn tỉnh Nam Định trong năm 2016 có tăng hơn so với năm 2015.
Tỉnh Lào Cai
Lào Cai là một tỉnh miền núi nằm ở phía Bắc Việt Nam, diện tích tự nhiên 6.383,89km2. Vị trí nằm ở các điểm: Phía Bắc giáp tỉnh Vân Nam - Trung Quốc; phía Nam giáp tỉnh Yên Bái; phía Đông giáp tỉnh Hà Giang; phía Tây giáp tỉnh Lai Châu. Lào Cai có 203,5 km đường biên giới với tỉnh Vân Nam - Trung Quốc. Lào Cai bao gồm 1 thành phố trực thuộc (Lào Cai) và 8 huyện (huyện Bảo Thắng, huyện Bảo Yên, huyện Bát Xát, huyện Bắc Hà , huyện Mường Khương, huyện Sa Pa, huyện Si Ma Cai, huyện Văn Bàn).
Tình hình chăn nuôi của tỉnh đa phần là chăn nuôi nhỏ lẻ và phát triển không đều trong những năm qua. Theo thống kê của Chi cục Thú y tỉnh Lào Cai tổng đàn gia cầm của tỉnh trong năm 2015 là 2.685.500 con tới năm 2016 tổng đàn gia cầm tăng lên là 3.034.200 con, trong đó có 2.88.000 con gà và 466.200 con vịt.
Tình hình chăn nuôi gia cầm (gà và vịt) trên 3 tỉnh/thành phố nghiên cứu được tổng hợp ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Tổng đàn gà, vịt trên địa bàn nghiên cứu từ năm 2015 đến 2016
Tỉnh/TP Năm Gà (Con) Vịt (con) Tổng đàn (con) Lào Cai 2015 2.283.100 402.400 2.685.500 2016 2.588.000 446.200 3.034.200 Nam Định 2015 5.267.400 1.835.200 7.102.600 2016 5.580.000 1.932.500 7.512.500 Hà Nội 2015 16.522.200 5.093.300 21.615.500 2016 17.191.000 5.553.300 22.744.300
Nguồn: Chi cục Thú y/Chăn nuôi và Thú y Nam Định, Lào Cai, Hà Nội 4.1.2. Kết quả tiêm phòng vacxin Cúm gia cầm tại 3 địa phương giai đoạn 2015-2016
Từ năm 2012 tới năm 2014 virus H5N1 lưu hành phổ biến ở miền Bắc và miền Trung thuộc clade 2.3.2.1, trong khi đó ở miền Nam thuộc clade 1.1. tuy nhiên các virus này đã có những biến đổi so với các chủng virus H5N1 đã lưu hành trong năm trước (BNN & PTNT, 2014). Trong năm 2015 xuất hiện các ổ dịch mới, virus cúm A/H5N6 mới xuất hiện và bùng phát mạnh mẽ.
Tới nay, tình hình dịch Cúm gia cầm diễn biến phức tạp, nguyên nhân gây bệnh mới là virus cúm type A/H5N6 đang gây bệnh chủ yếu trên địa bàn cả nước.
Kết quả tiêm phòng vacxin Cúm gia cầm của các tỉnh/ thành phố khác nhau. Một số tỉnh/thành phố tiến hành tiêm trên tất cả đối tượng gia cầm trên địa bàn, trong khi có tỉnh chỉ tiến hành tiêm bao vây ổ dịch khi có dịch. Số liệu chi tiết được trình bày tại bảng 4.2.
Bảng 4.2. Kết quả tiêm phòng vacxin Cúm gia cầm tại 3 địa phương giai đoạn 2015 - 2016
Năm Chỉ tiêu Lào Cai Nam Định Hà Nội
2015
Số gia cầm phải tiêm (con) 2.685.500 7.102.600 21.615.500
Số được tiêm (con) 1.792.400 * 21.615.500
Tỷ lệ (%) 66,74 * 100
2016
Số gia cầm phải tiêm (con) 3.034.200 7.512.500 22.744.300
Số được tiêm (con) 2.057.600 * 22.744.300
Tỷ lệ (%) 67,81 * 100
Ghi chú: * Không tiến hành tiêm phòng
Nguồn: Chi cục Thú y/Chăn nuôi và Thú y Nam Định, Lào Cai, Hà Nội
Qua bảng 4.2 chúng tôi có nhận xét như sau:
Thành phố Hà Nội
Thành phố Hà Nội là trung tâm văn hóa, kinh tế của cả nước là khu vực đông dân cư do vậy nhu cầu về thực phẩm là rất lớn. Chính vì vậy tình hình dịch bệnh trên địa bàn tỉnh luôn được chú trọng. Thành phố Hà Nội là một trong số các tỉnh/thành phố có tỷ lệ tiêm phòng cao nhất cả nước, luôn đạt hoặc vượt kế hoạch tiêm phòng cho đàn gia cầm với tỷ lệ tiêm phòng là 100%. Kế hoạch tiêm phòng vacxin Cúm gia cầm tại Hà Nội được triển khai 2 đợt chính trong năm, đợt 1 vào vụ xuân hè (từ tháng 4 đến tháng 5), đợt 2 vào vụ thu đông (từ tháng 9 đến tháng 10) theo hướng dẫn. Ngoài ra, việc tiêm phòng bổ sung hàng tháng đối với đàn gia cầm nuôi mới, tái đàn được chỉ đạo thực hiện thường xuyên và luôn đạt kết quả cao.
Tỉnh Lào Cai
Với điều kiện tự nhiên và khí hậu thuận lợi cho việc phát triển đại gia súc