3.3.1. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1. Đánh giá sinh trưởng, phát triển của 5 chủng nấm Linh Chi tại Vườn Quốc gia Tam Đảo
- 5 giống Linh Chi (GA-1; GA-2; GA-3; GA-4; GA-10) được cấy trên
nguyên liệu có thành phần như sau: 86% mùn cưa + 10% cám mạch + 3% bột
ngô + 1% CaCO3.
- Bịch nguyên liệu được xử lý và cấy giống tại Hà Nội, sau đó chuyển lên
vùng Tam Đảo để theo dõi giai đoạn nuôi sợi và giai đoạn ra quả thể.
Thí nghiệm 2. Đánh giá sinh trưởng, phát triển của 5 chủng nấm Linh Chi tại Hà Nội.
- 5 giống Linh Chi (GA-1; GA-2; GA-3; GA-4; GA-10) được cấy trên
nguyên liệu có thành phần như sau: 86% mùn cưa + 10% cám mạch + 3% bột
ngô + 1% CaCO3.
- Theo dõi giai đoạn nuôi sợi và giai đoạn ra quả thể.
Thí nghiệm 3
Phân tích hàm lượng dược liệu chính (polysaccharides, triterpenoid,) của một số chủng nấm Linh Chi trồng tại Vườn Quốc gia Tam Đảo.
- So sánh chất lượng chủng nấm Linh Chi trồng tại Vườn Quốc gia Tam Đảo và Chủng nấm Linh Chi trồng tại Hà Nội.
3.3.2. Các bước tiến hành 3.3.2.1. Nguyên liệu 3.3.2.1. Nguyên liệu
Linh Chi sử dụng nguyên liệu là mùn cưa của các loại gỗ mềm, không có tinh dầu và độc tố, không ẩm mốc.
3.3.2.2. Xử lý nguyên liệu
Tạo ẩm mùn cưa bằng nước sạch hòa vôi theo tỷ lệ 1%, ủ thành đống, đậy đống ủ bằng bạt nilon để mùn cưa ngấm đủ nước và trương nở các tế bào gỗ. Sau 2 - 3
3.3.2.3. Đóng túi
- Mùn cưa đã tạo ẩm được phối trộn thêm 10% cám mạch + 3% bột ngô
+ 1% CaCO3 trộn nhiều lần thật đều. Cho hỗn hợp trên vào túi 25 x 35, trọng
lượng mỗi túi đạt 1,2 kg. Luồn cổ nút vào miệng túi, buộc dây su, cho nút bông vào, đậy nắp lại, đưa vào nồi hấp.
3.3.2.4. Khử trùng
Phương pháp: Hấp bịch ở lò hấp. Hấp cách thủy ở nhiệt độ 100ºC, thời gian kéo dài 16-17 giờ sôi. Sử dụng than tổ ong để đun nước hấp bịch để nhiệt độ ổn định.
3.3.2.5. Cấy giống
Bước chuẩn bị: Giống: Giống Linh Chi trên hạt thóc , chọn giống đúng độ tuổi, không nhiễm: mốc, vi khuẩn, nấm dại.
Phòng cấy: sạch sẽ, được thanh trùng định kỳ bằng bột lưu huỳnh. Dụng cụ cấy giống: que cấy, đèn cồn, panh kẹp, kéo, cồn sát trùng, bông sạch, box cấy (tủ cấy). Nguyên liệu đã được khử trùng để nguội.
Cách cấy: Dùng bông thấm cồn lau box cấy, lau tay thật kỹ từ khuỷu tay đến bàn tay, kẽ tay bằng bông cồn. Các dụng cụ cấy (que cấy, panh kẹp, kéo) được lau bằng bông thấm cồn.Đốt đèn cồn trong box cấy, Lau chai giống, túi nguyên liệu cho vào tủ cấy. Mở nút chai giống phía trước ngọn lửa cồn, mở nút bông ở túi nguyên liệu ra, (nút bông được kẹp trên tay). Dùng que cấy hơ qua ngọn lửa cồn rồi khều giống cho vào túi nguyên liệu. Lắc cho giống đều trên bề mặt túi nguyên liệu, hơ nút bông qua ngọn lửa cồn rồi đậy vào cổ nút. Đưa túi nguyên liệu đã cấy giống ra khỏi box cấy và dùng giấy mỏng buộc lên trên cổ nút.
Như vậy ta đã hoàn thành xong một bịch phôi nấm Linh Chi, tiếp tục cấy các bịch nguyên liệu còn lại theo từng bước thao tác trên.
3.3.2.6. Ươm sợi
Chuẩn bị khu vực ươm:
Nhà ươm sợi phải đảm bảo các yêu cầu: Sạch sẽ, thông thoáng; Ánh sáng
trong phòng đủ để đọc sách, độ ẩm từ 75% đến 85%, nhiệt độ từ 20 đến 28oC.
Ươm bịch: Chuyển nhẹ nhàng các bịch được cấy giống vào nhà ươm, xếp thành từng luống. Giữa các luống có lối đi để kiểm tra. Trong thời gian ươm không được tưới nước trực tiếp vào bịch nấm. Hạn chế việc vận chuyển. Trong
quá trình sợi nấm phát triển quan sát kỹ, nếu thấy có túi bị nhiễm phải loại bỏ ra khỏi khu vực ươm, tránh lây nhiễm.
Khoảng 25 - 35 ngày, sợi tơ nấm mọc được 1/3 - 1/2 bịch nấm, bắt đầu có sự hình thành quả thể ở miệng cổ nút.
3.2.2.7. Chăm sóc, thu hái
Nhà trồng nấm phải đảm bảo sạch sẽ, thông thoáng, có mái chống nắng, mưa và chủ động được các điều kiện sinh thái như:
Nhiệt độ thích hợp thích hợp cho nấm mọc, dao động từ 22ºC - 28ºC, độ ẩm không khí đạt 80 - 90%, ánh sáng khuyếch tán và chiếu đều từ mọi phía (mức độ đọc sách được). Tránh gió lùa trực tiếp vào phòng nuôi trồng, độ thông thoáng vừa phải. Xếp các bịch nấm trên giàn giá (bịch nấm nằm ngang).
Tưới phun sương nhẹ nhàng vào túi nấm mỗi ngày từ 3 - 5 lần (tùy theo điều kiện thời tiết). Duy trì sự chăm sóc như trên cho đến khi mặt trên của quả thể nấm có một màu nâu đồng nhất (không còn màu trắng, vàng) nữa thì thu hái.
Thu hái: Dùng dao thật sắc, cắt cuống nấm sát bề mặt cổ nút. Quả thể nấm sau khi thu hái được phơi khô hoặc sấy ở nhiệt độ từ 40º - 45ºC (sấy ở nhiệt độ trên 45ºC sẽ làm mất tính chất dược liệu của nấm).
Khi thu hái hết đợt 1, tiến hành chăm sóc như lúc ban đầu để tận thu đợt 2, 3. Khi kết thúc đợt nuôi trồng cần phải vệ sinh và thanh trùng nhà xưởng thật kỹ bằng foocmon nồng độ 0,5 - 1%.
3.3.3. Phương pháp phân tích một số hoạt chất trong nấm Linh Chi
3.3.3.1. Quy trình phân tích ganodermanontriol, acid ganoderic a, acid lucidenic N trong nấm Linh Chi
Tiến hành theo phương pháp HPLC Điều kiện phân tích
- Cột C18 (5µm, 250 x 4,6 mm).
- Pha động: Kênh A:ACN; Kênh B: acid acetic 2 % - Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.
- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl. - Detector UV: 243 nm. Chương trình gradient:
Thời gian (phút) Kênh B Kênh A 0 – 5 25 75 5 – 20 25 – 40 75 – 60 20 – 40 40 60 40 – 50 40 – 80 60 – 20 50 – 65 80 20 65-70 80-25 20-75 70-80 25 75
Chuẩn bị dung dịch thử: Mẫu thử là dược liệu Nấm Linh Chi:Cân chính xác khoảng 2,0000 g dược liệu (đã xay nhỏ và xác định độ ẩm), chuyển vào bình cầu đáy tròn có dung tích 250 ml. Thêm 75 ml dung dịch ethanol 96%, đậy nắp, thấm ẩm dược liệu trong 10 phút, đun hồi lưu cách thủy trong 45 phút. Để nguội, lọc và rửa giấy lọc bằng ethanol 96% (2 lần, mỗi lần 10 ml). Cô dịch lọc thu được dưới áp suất giảm đến khô rồi hòa tan cắn trong bình định mức dung tích 25 ml với khoảng 20 ml ethanol 96%. Định mức vừa đủ rồi lọc qua màng lọc 0,45μl, thu được dung dịch tiến hành sắc ký.
Chuẩn bị dung dịch đối chiếu: Cân chính xác khoảng 5 mg mỗi loại chất đối chiếu, chuyển vào mỗi bình định mức 5,0 ml. Thêm 3 ml dung dịch ethanol 96%, lắc cho tan, định mức vừa đủ bằng dung dịch ethanol 96%, lắc đều được các dung dịch đối chiếu có nồng độ 1,0 mg/ml.
+ Tiến hành: Tiêm riêng biệt 10 µl mỗi dung dịch đối chiếu và dung dịch thử vào máy. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã mô tả, ghi sắc ký đồ.
Tính toán
Hàm lượng (%) chất phân tích trong dược liệu (tính theo khối lượng khô kiệt) được tính theo công thức:
St x Cc x 25 x P x 100
X = --- (%)
Sc x mT x (100 – B)
Trong đó:
St, Sc: diện tích pic dung dịch thử và dung dịch đối chiếu (mAu.s).
mc: khối lượng của chất đối chiếu (mg).
Cc: Nồng độ của chất đối chiếu (mg/ml). P: độ tinh khiết của chất đối chiếu (%) B: độ ẩm dược liệu (%)
3.3.3.2. Quy trình định lượng polysaccharid trong nấm Linh Chi Tiến hành theo phương pháp UV-VIS
Dung dịch đối chiếu: Cân chính xác khoảng 4 mg chuẩn glucose vào bình định mức 100ml, thêmnước cất, lắc cho tan, bổ sung vừa đủ thể tích bằng nước cất, lắc đều. được dung dịch chuẩn glucose có nồng độ 0,04mg/ml.
Dung dịch thử: Mẫu thử là dược liệu:Cân chính xác khoảng 1 g dược liệu (đã được xay nhỏ và xác định độ ẩm) vào bình cầu, thêm 100 ml dung dịch ethanol 80%, tiến hành chiết hồi lưu để loại tạp trong 1giờ. Chiết lặp lại với 100 ml ethanol 80%. Sau khi loaị tạp 2 lần, chiết dược liệu với 100 ml nước cất trong vòng 1h. Lọc dịch chiết vào bình định mức 100 ml. Rửa bình và bã dược liệu. Định mức vừa đủ bằng nước cất, lắc đều.
Tiến hành: Hút 2ml dịch thử và chuẩn cho vào bình tam giác có nút nhám, thêm 1 ml phenol 4 % và lắc đều; Thêm từ từ 7 ml axit sulfuric đặc vào bình nón,
lắc đều. Đun cách thủy ở nhiệt độ 400 trong 30 phút, làm lạnh 5 phút bằng nước đá.
Mẫu trắng được tiến hành tương tự mẫu thử, thay dịch thử bằng nước cất. Tiến hành đo quang ở bước sóng 490 nm.
Hàm lượng (%) polysaccarit trong Linh Chi được tính theo công thức:
At x Cc x P x 100
X = --- (%)
AC x Cbdx (1 – B)
Trong đó:
At: độ hấp thụ quang của dung dịch thử
Ac: độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn
Cc: nồng độ của chuẩn (mg/ml).
Cbd: nồng độ ban đầu mẫu thử (mg/ml).
P: độ tinh khiết của chất chuẩn acid gallic (%). B: độ ẩm của mẫu thử (%)
3.3.4. Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi Các chỉ tiêu theo dõi Các chỉ tiêu theo dõi
Giai đoạn hệ sợi
- Tốc độ mọc của sợi nấm được tính theo công thức: V = D/T V: Sinh trưởng trung bình của hệ sợi (mm/ngày)
D: Chiều dài bình (bịch) nguyên liệu sinh trưởng kín trắng (mm) T: Thời gian hệ sợi nấm mọc kín bịch nguyên liệu (ngày)
- Tỉ lệ nhiễm bệnh:
Tổng số bịch nhiễm
Tỷ lệ bịch nhiễm (%) = ──────────────── × 100% ` Tổng số bịch được nuôi cấy
Giai đoạn quả thể
- Thời gian hình thành mầm quả thể (ngày): Tính từ khi cấy giống đến khi ra mầm.
- Thời gian xuất hiện quả thể trưởng thành (ngày): Tính từ khi cấy giống đến khi quả thể trưởng thành.
- Kích thước dọc mũ nấm (mm), kích thước ngang mũ nấm (mm), số lớp mũ nấm/ cụm.
- Hiệu quả sinh học:
Khối lượng nấm tươi
Hiệu quả sinh học = ──────────────── × 100 Khối lượng nguyên liệu khô
+ Các chỉ tiêu khác
Hàm lượng dược liệu chính (polysaccharides, triterpenoid)
3.3.5. Phương pháp phân tích, xử lý số liệu
Số liệu sau khi tổng hợp được xử lý bằng các phần mềm xử lý thống kê IRISTART 4.0 và Microsoft Excel.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN CỦA 5 CHỦNG NẤM LINH CHI ĐƯỢC NUÔI TRỒNG TẠI VƯỜN QUỐC GIA CHỦNG NẤM LINH CHI ĐƯỢC NUÔI TRỒNG TẠI VƯỜN QUỐC GIA TAM ĐẢO
4.1.1. Đánh giá tốc độ mọc sợi của các chủng nấm và tỷ lệ nhiễm bệnh trong giai đoạn ươm sợi giai đoạn ươm sợi
Tại Việt Nam có nhiều triển vọng cho việc nuôi trồng nấm Linh Chi do có nguồn nguyên liệu và nhân lực dồi dào. Mùn cưa được sử dụng làm môi trường giá thể và chúng có hàm luợng cacbon rất cao. Tuy nhiên, mùn cưa là nguyên liệu nghèo chất dinh dưỡng. Do đó để nâng cao hiệu suất nuôi trồng nấm cũng như rút ngắn thời gian nuôi trồng thì cần thiết phải trộn thêm nhiều chất bổ sung. Chất bổ sung chủ yếu thường là cám gạo, cám ngô, đường… Các nguyên liệu này sẽ cung cấp các chất cần thiết cho hệ sợi nấm sinh trưởng nhanh.
Sau khi cấy giống bịch được chuyển sang phòng nuôi sợi, trong thời gian nuôi sợi liên tục kiểm tra để loại bỏ bịch nhiễm, phân tích nguyên nhân nhiễm và tìm biện pháp xử lý. Trong giai đoạn ươm sợi, bịch nấm bắt đầu xuất hiện nấm bệnh. Những bịch nấm không thấy hệ sợi phát triển màu trắng mà thấy bịch có hiện tượng mốc xanh hay mốc trắng đó là những bịch bị nhiễm bệnh. Hệ sợi không phát triển triển được nên ta phải loại bỏ những bịch bị nhiễm bệnh ra khỏi phòng ươm để tránh lây nhiễm sang các bịch khác.
Chúng tôi đã tiến hành khảo sát sinh trưởng nấm Linh Chi trên giá thể mùn cưa. Theo dõi sự phát triển của hệ sợi trong bịch và tỷ lệ nhiễm bệnh của của các chủng nấm Linh Chi trên giá thể mùn cưa có bổ sung dinh dưỡng, sau thời gian khoảng 40-50 ngày, khi hệ sợi lan kín bịch nguyên liệu, bịch được chuyển sang phòng nuôi có ánh sáng khuyếch tán, độ ẩm gần như bão hòa, thông khí, bắt đầu cho sự hình thành quả thể.
Kết quả theo dõi giai đoạn ươm sợi chúng tôi thu được kết quả được trình bày trong bảng 4.1.
Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi khá chậm vào khoảng 49-55 ngày tùy từng chủng, do nhiệt độ giai đoạn này ở ngưỡng hơi thấp. Nhiệt độ đo được thường là
biệt nhau quá lớn. Chủng GA1 thời gian hệ sợi mọc kín đáy bịch trung bình là ngắn nhất, thời gian hệ sợi mọc kín bịch nguyên liệu là 49 (ngày). Tiếp đến là chủng nấm GA10, thời gian hệ sợi mọc kín bịch nguyên liệu là 52 (ngày). Chủng GA2 VÀ GA4 có thời gian hệ sợi mọc kín bịch nguyên liệu lần lượt là 53 ngày. Chủng GA3 có thời gian hệ sợi mọc kín bịch nguyên liệu là chậm nhất đạt 55 ngày.
Bảng 4.1. Thời gian hệ sợi mọc kín bịch nguyên liệu của các chủng nấm và tỷ lệ nhiễm bệnh
Chủng nấm
Thời gian hệ sợi mọc kín bịch nguyên liệu (ngày) Tỷ lệ nhiễm bệnh (%) Đặc điểm hệ sợi nấm GA1 49 10,0
Hệ sợi khi non màu trắng muốt, sợi nấm dày, sợi nấm nhanh ngả màu vàng, nhanh hình thành mô sẹo so với các chủng cùng nghiên cứu
GA2 53 6,7
Hệ sợi khi non màu trắng muốt, sợi nấm đậm, mật độ sợi dày, sợi mượt như nhung, sợi nấm chậm ngả màu, khi già hình thành mô sẹo nhiều.
GA3 55 6,7
Hệ sợi khi non màu trắng, mật độ sợi phân bố đồng đều. Khi trưởng thành hệ sợi dày hơn, khi già không chuyển màu, không có mô sẹo.
GA4 53 8,9
Hệ sợi khi non màu trắng muốt, sợi nấm đậm, mật độ sợi dày, sợi mượt như nhung, sợi nấm chậm ngả màu, khi già hình thành mô sẹo nhiều. Hệ sợi chủng Ga-4 có nhiều đặc điểm giống hệ sợi chủng Ga-2
GA10 52 10,0
Hệ sợi khi non màu trắng muốt, sợi nấm mảnh, mật độ sợi trung bình, sợi nấm nhanh chuyển màu vàng, hình thành mô sẹo nhiều
Theo dõi về đặc điểm hệ sợi chúng tôi thu được kết quả ở cột 4 bảng 4.1. Đặc điểm hệ sợi của các chủng nấm khác nhau là khác nhau. Chủng nấm GA4 có
Theo dõi về tỷ lệ nhiễm bệnh trong giai đoạn ươm sợi, chúng tôi thu được kết quả ở cột 3 bảng 4.1.
Kết quả cho thấy giữa các giống khác nhau tỷ lệ nhiễm bệnh khác nhau, tuy nhiên tỷ lệ nhiễm bệnh không có sự chênh lệnh quá lớn. Giống có tỷ lệ nhiễm bệnh thấp nhất là giống GA2, GA3 đạt trung bình là 6,7% , tiếp đến là GA4 đạt trung bình là 8,9%. Tỷ lệ nhiễm bệnh cao nhất là giống GA10 và giống GA1 đạt trung bình lần là 10,0 % .
4.1.2. Đánh giá thời gian sinh trưởng của các chủng nấm Linh Chi
Sau pha ủ sợi kéo dài khoảng 40-50 ngày, khi hệ sợi bắt đầu bện kết, đưa các bịch nấm đã mọc trắng lên phòng nuôi, tiến hành tưới phun sương để duy trì độ ẩm 80 – 95%, ánh sáng nhẹ (700 – 800 lux), độ thông khí cao. Pha phát triển thể quả: ngày thứ 40-50 thì mầm quả thể bắt đầu hình thành, ngày thứ 55 – 85 thì mầm nấm đang trong giai đoạn tăng trưởng và từ ngày 90- 105 quả thể nấm bắt đầu già, có thể thu hái quả thể. Trong quá trình chăm sóc cần tưới nước dạng phun sương đều đặn, đảm bảo độ ẩm, nhiệt độ, khống chế ánh sáng và tránh gây tổn thương cơ học do ruồi, muỗi, chích hút…. Đặc biệt trong giai đoạn phát triển