3.3.3.1. Quy trình phân tích ganodermanontriol, acid ganoderic a, acid lucidenic N trong nấm Linh Chi
Tiến hành theo phương pháp HPLC Điều kiện phân tích
- Cột C18 (5µm, 250 x 4,6 mm).
- Pha động: Kênh A:ACN; Kênh B: acid acetic 2 % - Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.
- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl. - Detector UV: 243 nm. Chương trình gradient:
Thời gian (phút) Kênh B Kênh A 0 – 5 25 75 5 – 20 25 – 40 75 – 60 20 – 40 40 60 40 – 50 40 – 80 60 – 20 50 – 65 80 20 65-70 80-25 20-75 70-80 25 75
Chuẩn bị dung dịch thử: Mẫu thử là dược liệu Nấm Linh Chi:Cân chính xác khoảng 2,0000 g dược liệu (đã xay nhỏ và xác định độ ẩm), chuyển vào bình cầu đáy tròn có dung tích 250 ml. Thêm 75 ml dung dịch ethanol 96%, đậy nắp, thấm ẩm dược liệu trong 10 phút, đun hồi lưu cách thủy trong 45 phút. Để nguội, lọc và rửa giấy lọc bằng ethanol 96% (2 lần, mỗi lần 10 ml). Cô dịch lọc thu được dưới áp suất giảm đến khô rồi hòa tan cắn trong bình định mức dung tích 25 ml với khoảng 20 ml ethanol 96%. Định mức vừa đủ rồi lọc qua màng lọc 0,45μl, thu được dung dịch tiến hành sắc ký.
Chuẩn bị dung dịch đối chiếu: Cân chính xác khoảng 5 mg mỗi loại chất đối chiếu, chuyển vào mỗi bình định mức 5,0 ml. Thêm 3 ml dung dịch ethanol 96%, lắc cho tan, định mức vừa đủ bằng dung dịch ethanol 96%, lắc đều được các dung dịch đối chiếu có nồng độ 1,0 mg/ml.
+ Tiến hành: Tiêm riêng biệt 10 µl mỗi dung dịch đối chiếu và dung dịch thử vào máy. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã mô tả, ghi sắc ký đồ.
Tính toán
Hàm lượng (%) chất phân tích trong dược liệu (tính theo khối lượng khô kiệt) được tính theo công thức:
St x Cc x 25 x P x 100
X = --- (%)
Sc x mT x (100 – B)
Trong đó:
St, Sc: diện tích pic dung dịch thử và dung dịch đối chiếu (mAu.s).
mc: khối lượng của chất đối chiếu (mg).
Cc: Nồng độ của chất đối chiếu (mg/ml). P: độ tinh khiết của chất đối chiếu (%) B: độ ẩm dược liệu (%)
3.3.3.2. Quy trình định lượng polysaccharid trong nấm Linh Chi Tiến hành theo phương pháp UV-VIS
Dung dịch đối chiếu: Cân chính xác khoảng 4 mg chuẩn glucose vào bình định mức 100ml, thêmnước cất, lắc cho tan, bổ sung vừa đủ thể tích bằng nước cất, lắc đều. được dung dịch chuẩn glucose có nồng độ 0,04mg/ml.
Dung dịch thử: Mẫu thử là dược liệu:Cân chính xác khoảng 1 g dược liệu (đã được xay nhỏ và xác định độ ẩm) vào bình cầu, thêm 100 ml dung dịch ethanol 80%, tiến hành chiết hồi lưu để loại tạp trong 1giờ. Chiết lặp lại với 100 ml ethanol 80%. Sau khi loaị tạp 2 lần, chiết dược liệu với 100 ml nước cất trong vòng 1h. Lọc dịch chiết vào bình định mức 100 ml. Rửa bình và bã dược liệu. Định mức vừa đủ bằng nước cất, lắc đều.
Tiến hành: Hút 2ml dịch thử và chuẩn cho vào bình tam giác có nút nhám, thêm 1 ml phenol 4 % và lắc đều; Thêm từ từ 7 ml axit sulfuric đặc vào bình nón,
lắc đều. Đun cách thủy ở nhiệt độ 400 trong 30 phút, làm lạnh 5 phút bằng nước đá.
Mẫu trắng được tiến hành tương tự mẫu thử, thay dịch thử bằng nước cất. Tiến hành đo quang ở bước sóng 490 nm.
Hàm lượng (%) polysaccarit trong Linh Chi được tính theo công thức:
At x Cc x P x 100
X = --- (%)
AC x Cbdx (1 – B)
Trong đó:
At: độ hấp thụ quang của dung dịch thử
Ac: độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn
Cc: nồng độ của chuẩn (mg/ml).
Cbd: nồng độ ban đầu mẫu thử (mg/ml).
P: độ tinh khiết của chất chuẩn acid gallic (%). B: độ ẩm của mẫu thử (%)