3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.3.Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp điều tra thu thập thông tin
2.3.1.1. Điều tra thực trạng
Sử dụng bộ câu hỏi trong Biên bản kiểm tra điều kiện vệ sinh thú y, an toàn thực phẩm đối với CSGM gia súc, tại phụ lục số BB 2.16 của Thông tư 45/2014/TT-BNNPTNT lập thành phiếu điều tra để thu thập số liệu hiện trạng hoạt động CSGM; có các câu hỏi phỏng vấn chủ cơ sở, công nhân làm việc trong cơ sở, những người có liên quan đến nội dung nghiên cứu của đề tài.
Thời gian điều tra: Sáng từ 03 giờ đến 06 giờ, chiều từ 15 đến 18 giờ.
2.3.1.2. Đánh giá xếp loại cơ sở
Lỗi nhẹ (Mi): là sai lệch so với quy chuẩn kỹ thuật, có thể ảnh hưởng đến an toàn thực phẩm hoặc gây trở ngại cho việc kiểm soát ATTP nhưng chưa đến mức nặng.
Lỗi nặng (Ma): là sai lệch so với tiêu chuẩn, có thể ảnh hưởng đến ATTP, nếu kéo dài sẽ gây mất ATTP, tác động xấu đến môi trường.
Lỗi nghiêm trọng (Se): là sai lệch so với tiêu chuẩn, gây mất ATTP, tác động xấu đến môi trường, ảnh hưởng tới sức khỏe người tiêu dùng.
2.3.1.3. Xếp loại cơ sở
Xếp loại
Mức lỗi
Nhẹ (Mi) Nặng (Ma) Nghiêm trọng (Se)
Loại A ≤ 15 0 0 Loại B Từ 15 đến 30 0 0 Ma ≤ 15 và tổng Mi + Ma ≤ 30 0 Loại C Ma ≤ 15 và tổng Mi + Ma > 30 0 - > 15 0 - - ≥1
2.3.1.4. Diễn giải xếp loại
Cơ sở đủ điều kiện: Khi cơ sở xếp loại A hoặc B (xếp loại A khi đạt các điều kiện không có lỗi nặng và lỗi nghiêm trọng và tổng số sai lỗi nhẹ không quá 15 chỉ tiêu; xếp loại B khi không có lỗi nghiêm trọng và một trong 2 trường hợp hoặc không có lỗi nặng, tổng số lỗi nặng và lỗi nhẹ từ 15 – 30 chỉ tiêu hoặc số lỗi nặng không quá 15 chỉ tiêu và tổng số lỗi nhẹ và lỗi nặng không quá 30.
Cơ sở chưa đủ điều kiện: Khi cơ sở xếp loại C (xếp loại C khi mắc một trong các điều kiện có lỗi nghiêm trọng hoặc một trong các trường hợp: có lỗi nặng lớn hơn 15 chỉ tiêu hoặc có dưới hoặc bằng 15 lỗi nặng và tổng số lỗi nặng và lỗi nhẹ lớn hơn 30 chỉ tiêu).
2.3.2. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu
Mẫu được lấy ngẫu nhiên tại các cơ sở giết mổ và các cơ sở kinh doanh thịt tại địa điểm nghiên cứu.
Lấy mẫu và bảo quản mẫu theo QCVN 01 – 04: 2009; TCVN 7925: 2008 Thời gian lấy mẫu: tại CSGM vào lúc 5 giờ sáng, tại CSKD lúc 8 - 9 giờ sáng. Mẫu đựng trong các hộp vô trùng, bảo quản lạnh và được vận chuyển về phòng kiểm nghiệm, phân tích ngay trong 1 – 2 giờ đầu.
2.3.3. Phương pháp phân tích một số chỉ tiêu vi sinh vật
2.3.3.1. Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trên thịt: TCVN 7928: 2008 * Nguyên tắc
Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn sinh trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm. Chỉ số này được xác định bằng cách sử dụng kỹ thuật đổ đĩa trên cơ sở số lượng mẫu đã xác định và xem một khuẩn lạc là sinh khối phát triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu.
Đếm số khuẩn lạc đã mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ các nồng độ pha loãng khác nhau, sau khi nuôi cấy ở 370
C trong 24 - 48 giờ. Số khuẩn lạc được tính trong 1g hay 1ml mẫu.
* Cách tiến hành
Bước 1: lấy mẫu theo QCVN 01 – 04: 2009 Bước 2: đồng nhất mẫu và pha loãng
Đồng nhất mẫu:
Cân 1g thịt cho vào cối đã được tiệt trùng. Sau đó cho thêm vào 9ml dung dịch đệm pepton, tiến hành nghiền nhỏ thịt, ta thu được độ pha loãng 10-1
. Pha loãng mẫu:
Chuẩn bị các ống eppendorf và các micropipette vô trùng. Dịch mẫu đồng nhất được tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng micropipette với đầu tuýp vô trùng hút 0,1ml dịch mẫu 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 0,9ml dung dịch đệm pepton, trộn đều mẫu trong ống nghiệm cho đồng nhất bằng máy rung (vortex) ta có được độ pha loãng 10-2, tương tự ta lấy 0,1ml dịch mẫu 10-2
cho vào ống nghiệm chứa 0,9ml dung dịch đệm pepton đã chuẩn bị sẵn ta có độ pha loãng 10-3. Cứ tiếp tục như vậy ta sẽ có các nồng độ 10-4
, 10-5, 10-6... Lưu ý khi pha loãng mẫu:
Nồng độ pha loãng phụ thuộc vào tình trạng vệ sinh của bệnh phẩm, thời gian bảo quản, điều kiện bảo quản, kinh nghiệm người tiến hành thí nghiệm.
Tiến hành thao tác bên ngọn lửa đèn cồn. Các ống nghiệm phải tuyệt đối vô trùng. Sử dụng 1 micropipet 1ml/1 nồng độ pha loãng mẫu tránh hiện tượng sai số.
Mỗi lần lấy mẫu phải lắc đều.
Tất cả thao tác phải tiến hành trong điều kiện vô trùng. Bước 3: Cấy mẫu
Đổ môi trường thạch dinh dưỡng PCA đã hấp vô trùng, để nguội 450C, trộn đều bằng cách xoay ngược chiều nhiều lần nhẹ nhàng rồi để các đĩa đông tự nhiên. Dùng micropipet với đầu típ vô trùng hút 0,1ml mẫu ở các nồng độ pha loãng cho vào đĩa petri trải cấy bằng phương pháp lắc bi. Lắc nhẹ nhiều lần để mẫu phân tán đều vào môi trường, lật ngược đĩa và ủ ở 36 - 380
C trong 24 - 48 giờ. Mỗi nồng độ cấy vào 2 đĩa peptri.
Bước 4: Đọc kết quả
Sau 24 giờ nuôi cấy thì ta tính kết quả sơ bộ bằng cách đếm khuẩn lạc trên đĩa nuôi cấy. Chỉ tính kết quả khi sự phân bố khuẩn lạc trên các đĩa là hợp lý với mối tương quan giữa độ pha loãng và số khuẩn lạc mọc trên đó (Francis and O’Beirne, 2002).
Tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1g sản phẩm được tính theo công thức sau:
X= C
(n1 + 0,1n2) dV
Trong đó:
C - tổng số khuẩn lạc của 4 đĩa ở hai độ pha loãng được đếm n1 - số đĩa được đếm ở độ pha loãng thứ nhất (2 đĩa)
n2 - số đĩa được đếm ở độ pha loãng thứ hai (2 đĩa)
d - hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất.
V- thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa
2.3.3.2. Phương pháp xác định và tính số lượng E.coli: TCVN 7924-2: 2008 * Nguyên tắc
Mẫu đã được đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose, ủ ở 370C trong 24 giờ, đếm các khuẩn lạc có hình dạng đặc trưng.
* Các bước tiến hành
Bước 1: Lấy mẫu theo QCVN 01 – 04: 2009 Bước 2: Đồng nhất mẫu và pha loãng
Đồng nhất mẫu:
Cân 1g thịt cho vào cối đã được tiệt trùng. Sau đó cho thêm vào dung dịch đệm pepton, tiến hành giã nhỏ thịt, ta thu được độ pha loãng 10-1
. Pha loãng mẫu:
Chuẩn bị các ống eppendorf và các micropipette vô trùng. Dịch mẫu đồng nhất được tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng micropipette với đầu tuýp vô trùng hút 0,1ml dịch mẫu 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 0,9ml dung dịch đệm pepton, trộn đều mẫu trong ống nghiệm cho đồng nhất bằng máy rung (vortex) ta có được độ pha loãng 10-2, tương tự ta lấy 0,1ml dịch mẫu 10-2
cho vào ống nghiệm chứa 0,9ml dung dịch đệm pepton đã chuẩn bị sẵn ta có độ pha loãng 10-3. Cứ tiếp tục như vậy ta sẽ có các nồng độ 10-4
Bước 3: Nuôi cấy dịch mẫu
Đổ môi trường thạch dinh dưỡng Eosin Methylene Blue (EMB) đã hấp vô trùng, để nguội 450C, trộn đều bằng cách xoay ngược chiều nhiều lần nhẹ nhàng rồi đổ ra đĩa petri, mỗi đĩa từ 12 -15ml, sau đó để các đĩa đông tự nhiên.
Chọn 2 độ pha loãng liên tiếp, dùng micropipet với đầu típ vô trùng hút 0,1ml dịch mẫu ở các nồng độ pha loãng cho vào đĩa petri. Tương ứng với mỗi độ pha loãng cấy lên 2 đĩa petri. Sau khi hút dịch mẫu ra môi trường thì dùng que dàn, dàn mẫu để mẫu phân tán đều vào môi trường, lật ngược đĩa và để vào tủ ấm ở 36 – 380C trong 24 - 48 giờ.
Quá trình phân tích chỉ tiêu E. coli được tóm tắt theo quy trình sau:
Bước 4: Đọc kết quả
Sau 24 giờ nuôi cấy mang ra đọc kết quả. Khuẩn lạc của vi khuẩn E. coli
trên môi trường EMB có màu tím ánh kim. Chỉ tính kết quả khi sự phân bố khuẩn lạc trên các đĩa là hợp lý với mối tương quan giữa độ pha loãng và số khuẩn lạc mọc trên đó.
Mẫu - pha loãng mẫu có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3,…
Đổ 10-15ml môi trường EMB đã hấp tiệt trùng vào các đĩa petri
Nuôi ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ
Đếm và tính kết quả (CFU/g) hoặc CFU/ml)
Chọn các nồng độ pha loãng thích hợp, chuyển 0,1ml mẫu vào đĩa petri
Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 30 – 300 để tính kết quả.
Số vi khuẩn E. coli trong 1g sản phẩm được tính theo công thức sau:
X= C
(n1 + 0,1n2) dV Trong đó:
C - tổng số khuẩn lạc của 4 đĩa ở hai độ pha loãng được đếm n1 - số đĩa được đếm ở độ pha loãng thứ nhất (2 đĩa)
n2 - số đĩa được đếm ở độ pha loãng thứ hai (2 đĩa)
d - hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất.
V- thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa
2.3.3.3. Phương pháp phát hiện Salmonella
* Nguyên tắc
Salmonella có thể được phát hiện (phân tích định tính) bằng một quy trình gồm 4 bước là tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định Salmonella
thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, và cùng hiện diện chung với một số lượng lớn các vi khuẩn khác thuộc họ Enterrobateriaceae có tính cạnh tranh mạnh và ức chế sự tăng trưởng của Salmonella.
Đếm số khuẩn lạc đã mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ các nồng độ pha loãng khác nhau, sau khi nuôi cấy ở 37oC trong 24 giờ.
* Các bước tiến hành
Bước 1: Lấy mẫu theo QCVN 01 – 04: 2009 Bước 2: Đồng nhất mẫu và pha loãng
Cân 25g thực phẩm (thịt tươi) cho vào cối đã được tiệt trùng. Sau đó cho thêm vào 225ml dung dịch đệm Peptone, tiến hành giã nhỏ thịt, ta thu được độ pha loãng 10-1.
Chuẩn bị các ống eppendorf và các micropipette vô trùng. Dịch mẫu pha loãng được tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng micropipet với đầu vô trùng chuyển 0,1ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 0,9ml dung dịch đệm, trộn đều mẫu trong ống nghiệm cho đồng nhất bằng máy trộn (vortex) ta có được độ pha loãng 10-2
.
Bước 3: Nuôi cấy mẫu
Dùng micropipet với đầu vô trùng hút 1ml mẫu ở nồng độ pha loãng 10-1 cho vào môi trường canh thang. Lắc nhẹ nhiều lần để mẫu phân tán đều vào môi trường, bỏ vào tủ ấm ở 37oC trong 24 giờ.
Đổ môi trường thạch dinh dưỡng Salmonella- Shigella Agar (SS agar) đã hấp vô trùng, để nguội 450C, trộn đều bằng cách xoay ngược chiều nhiều lần nhẹ nhàng rồi để các đĩa đông tự nhiên.
Dùng micropipet với đầu típ vô trùng hút 0,1ml mẫu ở các nồng độ pha loãng cho vào đĩa petri. Dùng que dàn, dàn mẫu để mẫu phân tán đều vào môi trường, lật ngược đĩa và ủ ở 370
C trong 24 – 48 giờ.
Sau 24 giờ đọc kết quả, dùng que cấy bắt những khuẩn lạc nghi ngờ để thực hiện kỹ thuật cấy thuần.
Bước 4: Đọc kết quả
Sau 24 - 48 giờ mang các đĩa petri đã cấy vi khuẩn ra đọc kết quả. Khuẩn lạc của vi khuẩn Salmonella trên môi trường thạch SS agar có tâm màu đen, viền màu hồng Quy trình kiểm nghiệm này chỉ cho phép phân tích định tính Salmonella, giúp kết luận có hay không có Salmonella hiện diện trong 25g mẫu, không cho phép phân biệt được các dòng Salmonella hiện diện trong mẫu.
2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được nhập và xử lý sơ bộ trên phần mềm Excel theo phương pháp thống kê mô tả;
t - Test: Two -Sample assuming unequal variances; và phần mềm kiểm định tỷ lệ thống kê EpiCalc2000.
Các giá trị được biểu thị dưới dạng giá trị % và giá trị trung bình (CFU/g). Tỷ lệ mẫu không đạt tiêu chuẩn = Số mẫu không đạt tiêu chuẩn/ tổng số mẫu kiểm tra.
Các giá trị được coi là khác nhau có ý nghĩa thống kê khi p<0,05 (độ tin cậy 95%).
CHƯƠNG 3.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả đánh giá thực trạng cơ sở giết mổ
3.1.1. Loại hình cơ sở giết mổ
Tiến hành điều tra tất cả các CSGM trên địa bàn huyện ta thu được kết quả nêu tại bảng 3.1:
Bảng 3.1. Số lượng và quy mô giết mổ
STT Địa điểm Số lượng
Cơ sở Quy mô giết mổ (con/ngày)
1 Xã Hoài Sơn 6 1-2 2 Xã Hoài Châu Bắc 12 1-2 3 Xã Hoài Châu 9 1-3 4 Xã Hoài Phú 3 1-2 5 Xã Hoài Hảo 6 1-2 6 Thị trấn Tam Quan 8 1-3 7 Xã Tam Quan Bắc 13 1-3
8 Xã Tam Quan Nam 6 1-2
9 Xã Hoài Thanh 10 1-2
10 Xã Hoài Thanh Tây 9 1-2
11 Xã Hoài Tân 8 1-3 12 Thị trấn Bồng Sơn 4 2-3 13 Xã Hoài Đức 8 1-2 14 Xã Hoài Xuân 7 1-2 15 Xã Hoài Hương 7 1-2 16 Xã Hoài Mỹ 6 1-2 17 Xã Hoài Mỹ 0 0 TỔNG 122
Từ số liệu trong bảng 3.1 cho thấy hầu hết các xã, thị trấn (trừ xã Hoài Hải) đều có các CSGM; xã nhiều nhất là Tam Quan Bắc 13 cơ sở, chiếm 18,9% toàn huyện, xã có CSGM ít nhất là 3 cơ sở (xã Hoài Phú). Quy mô giết mổ phổ biến chủ yếu là nhỏ lẻ, từ 1 - 3 con lợn/ngày đêm. Trung bình hàng ngày trên địa bàn huyện giết mổ khoảng 200 con lợn. Sau khi giết mổ thịt được bán tại các CSKD là các chợ trong huyện; một số ít được các tiểu thương ở huyện Đức Phổ (tỉnh Quảng Ngãi) tiêu thụ. Tất cả các cơ sở đều giết mổ thủ công, diện tích sử dụng nhỏ, giết mổ trên sàn, cơ sở hạ tầng không đảm bảo vệ sinh thú y theo quy định. Đây cũng là hình thức giết mổ phổ biến ở Bình Định, một trong các hình thức kinh doanh nhỏ lẻ trong chuỗi sản xuất - tiêu dùng.
3.1.2. Xây dựng cơ bản và trang thiết bị giết mổ
Kết quả điều tra cho thấy tất cả 122 cơ sở do các hộ kinh doanh giết mổ tự xây dựng, hoặc tận dụng một phần nhà ở, công trình phụ làm nơi giết mổ lợn, không có hướng dẫn của cơ quan chuyên môn, không đảm bảo yêu cầu vệ sinh thú y. Xây dựng không có quy hoạch, chủ yếu xây dựng trên đất ở, sử dụng đất sai mục đích, không đúng với quy định. Kết quả cho thấy 100% cơ sở mắc lỗi nghiêm trọng.
Mặt khác, 100% cơ sở mắc lỗi nặng vì xây dựng tại nhà ở, gần khu dân cư, không đảm bảo quy định về khoảng cách từ CSGM đến khu dân cư, nơi thường xuyên tập trung đông người, trường học, bệnh viện, đường giao thông chính, nguồn nước mặt tối thiểu 500m; cách trại chăn nuôi, chợ buôn bán gia súc, gia cần tối thiểu 1.000m. Không có hố sát trùng hoặc phương tiện khử trùng xe và người ra vào khu giết mổ. Khu sạch và khu bẩn không phân cách nhau. Việc nhập lợn vào và xuất các sản phẩm chung một cửa. Toàn bộ quy trình từ cạo lông, mổ, tách nội tạng, xẻ thịt đều thực hiện trên một mặt nền. Mặc dù hầu hết các CSGM đều có nơi tồn trữ, giết mổ và xử lý chất thải nhưng chuồng nhốt tạm bợ, ẩm ướt, nhiều cơ sở nền chuồng nhốt lợn cao hơn mặt sàn, nước rửa chuồng chảy qua sàn giết mổ vào cống nước thải.
Về cơ sở vật chất và trang thiết bị giết mổ qua kết quả điều tra cho thấy