hưởng đến kết quả xét nghiệm
1.2.4.1. Phương pháp định lượng nồng độ resistin, visfatin
- Resistin và visfatin có cấu trúc là các polypetide, trọng lượng phân tử của resistin là 12,5kDa gồm 108 acid amin, visfatin là 52 kDa gồm 491 acid amin. Nồng độ các polypetide, protein, hormone trong các dịch sinh học được xác định bằng nhiều phương pháp khác nhau. Hiện nay dùng phổ biến nhất trong nghiên cứu và lâm sàng là phương pháp miễn dịch enzyme (EIA,
ELISA). Tất cả các phương pháp xét nghiêm đều dùng enzyme để phát hiện phản ứng kháng nguyên, kháng thể. Nguyên lý của phản ứng giống nhau. Các loại xét nghiệm ELISA hiện có 2 phương pháp đó là ELISA đồng nhất và ELISA không đồng nhất. Phương pháp ELISA đồng nhất là các enzyme không được hoạt hóa khi gắn với kháng nguyên và do đó không cần đến công đoạn rửa khi tách kháng nguyên khỏi dịch đệm, phương pháp này thường dùng để định lượng các chất có nồng độ thấp, phương pháp này đắt tiền và có độ nhậy thấp. Phương pháp ELISA không đồng nhất được sử dụng thường xuyên hơn. Các loại xét nghiệm ELISA của phương pháp này cần loại các yếu tố nhiễu bởi các phân tử khác bằng cách sau khi phức hợp KN-KT đã được gắn trên thành ống nghiệm cần trải qua bước rửa các phân tử gây nhiễu.
- Các loại xét nghiệm ELISA: trực tiếp, gián tiếp, kẹp (sandwich), cạnh tranh.
- Phương pháp ELISA được sử dụng rất phổ biến để định lượng các peptide và protein, xét nghiệm cho kết quả nhanh có độ nhạy, độ đặc hiệu và dễ tiến hành không cần các thiết bị phức tạp như RIA nhưng độ nhạy gần tương đương. Tổng hợp các ưu điểm và hạn chế của các loại xét nghiệm ELISA như sau:
Loại XN Phát hiện hạn chế ưu điểm Trực tiếp KT (+) giả Độ nhậy thấp Gián tiếp KN/KT cố định không đặc hiệu Độ nhậy cao Kẹp KN - Độ nhậy rất cao Cạnh tranh KT - Độ nhậy cao
Nguyên lý phương pháp ELISA để định lượng resistin và visfatin
- Nguyên lý: Phản ứng kết hợp kháng nguyên-kháng thể kiểu sandwich. - Dựa trên phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể được gắn ở đáy giếng ELISA với kháng nguyên resistin, visfatin có trong huyết thanh bệnh nhân kết hợp với sự chuyển màu cơ chất đặc hiệu trong phản ứng ELISA.
1.2.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả của xét nghiệm resistin, visfatin. - Các yếu tố kỹ thuật
- Các bước tiến hành xét nghiệm và một số yếu tố ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm.
Xét nghiệm ELISA chia làm 3 khâu chủ yếu. Tất cả các khâu đều có thể sai sót ảnh hưởng đến kết quả.
+ Khâu chuẩn bị dụng cụ và hóa chất gồm các dụng cụ chuyên dùng, ống nghiệm, automatic pipette, dịch chuẩn, dịch đệm, chứng dương và mẫu v.v… Đây là khâu rất quan trọng trước khi tiến hành xét nghiệm.
Những sai sót hay gặp nhất khâu này là sự thất bại khi thêm các chất ức chế enzyme vào các ống nghiệm để ngăn các peptide và protein chống lại các protease.
+ Khâu tiến hành xét nghiệm gồm 10 công đoạn khác nhau theo quy trình (xin được trình bày chi tiết ở phần phương pháp nghiên cứu).
+ Khâu phân tích kết quả.
- Lấy mẫu và bảo quản mẫu: sau khi ly tâm các mẫu cần được bảo quản ở nhiệt độ từ −20◦C đến −80◦C cho đến khi làm xét nghiệm.
- Pha tiến hành xét nghiệm
Sai số do sử dụng các kít khác nhau để định lượng các chất trên cùng 1 bệnh nhân, sai sót trong các bước tiến hành đều có ảnh hưởng chung đến kết quả [86].
- GH thấy ở bệnh nhân to đầu chi (acromegaly) tăng tỷ lệ ĐTĐ và THA.
- Tăng glucose máu làm tăng oxygen phản ứng (ROS) và nitrogen phản ứng (RNS), hai chất này gây stress oxy hóa dẫn đến bất thường về biểu hiện gen. - Hormon steroid Desamethason làm tăng biểu hiện của mRNA resistin.
- Hormon sinh dục làm tăng biểu hiện của mRNA resistin và có liên quan giữa hormon steroid và chuyển hóa glucose, gây thừa cân, béo phì và ĐTĐ.
- Neuropetid Y(NPY) có vai trò điều hòa biểu hiện gen resistin ở mô mỡ trắng và ở chất trắng của não.
- Tuổi tình trạng TCBP và ĐTĐ tăng theo tuổi. Khối mỡ và mỡ tạng cũng tăng theo tuổi nhất là sau 65 tuổi [65]. Các chất ức chế biểu hiện resistin:
+ Insulin có thể ức chế biểu hiện resistin thông qua con đường p13- kinase hoặc MAPK.
+ Nhịn ăn làm giảm biểu hiện resistin ở mô mỡ trắng nhưng không thay đổi ở mô mỡ nâu.
+ Somatropin, hormone tuyến giáp, endothelium-1, neurotransmiter - Các yếu tố dinh dưỡng thiếu vitamin E, vitamin D. Những bệnh nhân bị bệnh thận do ĐTĐ dùng chế độ ăn nghèo năng lượng làm giảm nồng độ resistin và các marker viêm [87], [88].
- Điều trị ĐTĐ bằng rosiglitazone (RSG) ức chế sự kích thích và bài tiết resistin của insulin. Tác dụng tương tự đối với các cytokines tiền viêm khác như leptin, IL-6, TNF-α, tác dụng giảm resistin của RSG có thể liên quan đến các cơ chế khác của RSG với sự tăng độ nhạy của insulin [89].
- Phụ nữ có hội chứng buồng trứng đa nang nồng độ resistin, visfatin tăng cao so với nhóm chứng[77].
- Có mối liên quan giữa tình trạng viêm quanh răng ở bệnh nhân ĐTĐ với tăng nồng độ resistin [90]. Nồng độ resistin ở nước bọt của bệnh nhân ĐTĐ týp 2 tăng so với người không ĐTĐ và không bị ảnh hưởng bởi bữa ăn và có tương quan với nồng độ resistin trong huyết thanh [91].
- Các bệnh cũng có ảnh hưởng đến nồng độ các chất trong các dịch sinh học.
Vấn đề quan trọng trong xét nghiệm ELISA là việc sử dụng các Kit. Cho đến nay có khoảng 40 công ty trên thế giới sản xuất Kit dùng trong xét nghiệm. Kít của các công ty khác nhau, nghiệm của các kỹ thuật viên có thể ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bộ kit của hãng Sigma-Aldrich nay thuộc hãng Merck Hoa kỳ
- Các yếu tố khác có thể ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm như các thuốc đang dùng, các thức ăn, cafe, chè đặc, uống rượu. Tuổi, giới, nhịp ngày đêm, sốt cao, thiếu vitamin D, …
Tuy nhiên đây là hai chất mới có nguồn gốc từ mô mỡ là chủ yếu, chức năng của chúng cũng còn nhiều vấn đề chưa đồng thuận giữa các nghiên cứu. Trên thực tế lâm sàng nghiên cứu rất khó chọn được mẫu thuần tập nên khó tránh khỏi sai số. Khắc phục vấn đề thường cố gắng tăng cỡ mẫu nghiên cứu
1.3. Mối liên quan giữa nồng độ resistin, visfatin với một số yếu tố nguycơ tim mạch – chuyển hóa ở bệnh nhân ĐTĐ týp 2 trên thế giới và trong