CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.4. Phương pháp thu thập số liệu nghiên cứu
- Lựa chọn bệnh nhân, lập mẫu bệnh án nghiên cứu thống nhất.
- Khai thác thông tin, thu thập số liệu nghiên cứu, vào hồ sơ bệnh án nghiên cứu.
2.2.4.1. Khám lâm sàng Khai thác bệnh sử. Khám thực thể.
Đo các chỉ số cơ thể, tính tốn các chỉ số nhân trắc, đo huyết áp. 2.2.4.2. Phương pháp lấy mẫu và sử dụng mẫu
- Lấy máu tĩnh mạch vào buổi sáng, lúc đói. - Mẫu máu chia 2 phần:
Phần 1: dùng để xét nghiệm các chỉ số công thức máu và các chỉ số hóa sinh.
Phần 2: Lấy máu định lượng resistin và visfatin số lượng 5 ml cho vào ống nghiệm nắp đỏ có hạt silicone (khơng có chất chống đơng).
- Ly tâm tốc độ 4000 vòng/phút trong vòng 10 phút, dùng pipet tách lấy phần huyết thanh chia vào các ống Eppendorf sau đó bảo quản lạnh ở - 800C.
2.2.4.3. Vận chuyển mẫu
- Mẫu huyết thanh sau khi thu thập đầy đủ được bảo quản ở nhiệt độ -
800C vận chuyển đến Bộ môn Sinh lý bệnh, Học viện Quân y.
Quá trình vận chuyển (ống nghiệm đựng huyết thanh được đánh số kí hiệu bảo quản trong hộp xốp chứa đá khơ). Theo quy trình vận chuyển mẫu của đề tài nghiên cứu cấp tỉnh Nghệ an với các mẫu lấy tại Bệnh viện Nội tiết Nghệ an. Mẫu lấy tại tại Khoa Hóa sinh, Bệnh viện Quân y 103, Học viện Quân y được tách huyết thanh và chuyển đến Bộ môn Sinh lý bệnh, Học viện Quân y, tất cả các mẫu sau khi tiếp nhận được bảo quản âm sâu – 800C cho đến khi tiến hành xét nghiệm.
2.2.4.4. Các xét nghiệm hoá sinh
* Định lượng các thành phần lipid máu:
- Các thành phần lipid máu bao gồm: cholesterol toàn phần, triglyceride toàn phần, HDL – C (hight density lipoprotein – cholesterol), LDL – C (low density lipoprotein – cholesterol).
- Phương pháp: định lượng theo phương pháp enzyme so màu. - Máy sử dụng: máy xét nghiệm sinh hoá tự động AU 680 của Mỹ. Nồng độ LDL-C tính theo cơng thức Friedewald’ LDL-C = TC – HDL – (TG/5) [131]
- Các chỉ số đánh giá rối loạn lipid máu, các chỉ số sinh vữa xơ động mạch và nguy cơ tim mạch (atherogenic index)
Atherogenic coefficient (AC) = (TC- HDL-C) / HDL-C Atherogenic index of plasma (AIP) = [log10 (TG / HDL-C] Castelli Risk Index I (CRI-I) = (TC / HDL-C)
Castelli Risk Index II (CRI-II) = (LDL-C / HDL-C).
- Các chỉ số được coi là nguy cơ khi: AIP >0.1, CRI-I >3.5 ở nam >3.0
ở nữ, CRI-II >3.3, AC >3.0, và CHOL Index >2.07 [132],[133],[134]
* Định lượng glucose máu:
- Phương pháp định lượng: Đo UV với hexokinase - Máy sử dụng: AU 680 của Mỹ.
- Đánh giá kết quả: theo tiêu chuẩn chẩn đoán (mmo/l).
* Định lượng insulin máu
- Phương pháp định lượng: Insulin máu được định lượng theo phương
pháp miễn dịch hóa phát quang trên máy xét nghiệm miễn dịch tự động Achitech i2000SR của hãng Abbott.
- Nguyên lý: Phản ứng kết hợp kháng nguyên kháng thể kiểu sandwich [135].
- Tiến hành: Insulin trong bệnh phẩm được ủ với kháng thể kháng insulin (insulin-specific antibody); sau đó tiếp tục ủ với kháng thể đánh dầu bằng biotin kháng kháng thể kháng insulin; phản ứng tạo thành phức hợp kháng nguyên – kháng thể - kháng thể gắn chất đánh dấu biotinyl (sandwich complex). Sau đó phức hợp này lại được ủ tiếp với các vi hạt (microparticles) được bọc bởi streptavidin.
Phức hợp tạo thành được bao bọc bởi dung dịch đặc qua sự tương tác của biotin và streptavidin. Phức hợp phản ứng được đưa vào buồng đo, các vi hạt được bao bọc có từ tính thốt lên trên bề mặt của điện cực, các chất không được bao bọc được loại bỏ bằng procell. Áp điện thế với điện cực cảm ứng phát quang bằng phản ứng hóa học và kết quả được đo đạc bằng bộ nhân quang.
Đơn vị biểu thị: µU/ml.
- Tăng nồng độ insulin máu khi kết quả định lượng của bệnh nhân lớn hơn tứ phân vị trên của nhóm chứng
- Giảm nồng độ insulin máu khi kết quả định lượng của bệnh nhân lớn hơn tứ phân vị dưới của nhóm chứng
- Tăng nồng độ (cường tiết) insulin máu khi kết quả định lượng của bệnh nhân >12 μU/mL cho cả nam và nữ theo Tohidi. M và cộng sự (2014) [136]
- Tính các chỉ số đánh giá kháng insulin:
+ Chỉ số HOMA-IR: Chỉ số kháng insulin theo công thức của
Matthews [137]
HOMA-IR (Homeostasis Model Asessment insulin Resistance):
Kháng insulin được xác đinh khi HOMA-IR>2,6 theo Yin, Jinhua [138]
+ Chỉ số QUICKI: Chỉ số độ nhạy của insulin.
QUICKI (Quantitative insulin Sensitivity Check Index) được tính theo cơng thức của Kazt và cộng sự (2000) [139]
QUICKI =
1
Log [I0(µU/ml) + G0(mmol/L)]
Bệnh nhân có kháng insulin khi QUICKI < 0.382±0.007 ở người KTCBP, 0,331±0,010 ở người TCBP 0,304±0,007 ở bệnh nhân ĐTĐ theo Gutch. M (2015) [39].
+ Chỉ số đánh giá chức năng tế bào β (HOMA-β): Đánh giá khả năng tiết insulin của tế bào β (cơng thức của Matthews) [137]
HOMA-IR = I0(µU/ml) x G0(mmol/L) 22,5
HOMA-β = I0 (µU/ml) x 20 G0 (mmol/L) – 3,5 Chỉ số HOMA-β bình thường: >116.65%[140] G0: nồng độ insulin máu lúc đói
I0: nồng độ insulin máu lúc đói
Chỉ số Mc Auley
Mc auley index= e (2,63-0,28 ln (I0)–0,31 ln (TAG0) TAG0 nồng độ triglyceride lúc đói
I0: nồng độ insulin máu lúc đói
Bình thường Mc Auley index <5,8[39] + Chỉ số TyG tính theo cơng thức:
Ln (TG [mg/dL] × glucose [mg/dL] TyG index= 2
Kháng insulin khi TyG>4,65 [40]
* Định lượng HbA1c máu lúc đói:
Sử dụng phương pháp trao đổi ion bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography – HPLC) kết hợp với tách rửa theo mức gradient để tách các phân nhóm hemoglobin và các biến thể (HbC, HbS, HbD) từ lượng huyết cầu có trong máu tồn phần ở người.
Xét nghiệm bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp, được tiến hành trên máy DS360 (Hoa Kỳ).
- Đơn vị đo: %.
- Giá trị bình thường HbA1c: 4,4 – 6,4%.
2.2.4.5. Định lượng nồng độ resistin
* Nguyên lý:
Nguyên lý: Phản ứng kết hợp kháng nguyên kháng thể kiểu sandwich. Dựa trên phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể được gắn ở đáy giếng ELISA với
kháng nguyên resistin có trong huyết thanh bệnh nhân kết hợp với sự chuyển màu cơ chất đặc hiệu trong phản ứng ELISA. Sử dụng bộ kít xét nghiệm của hãng Sigma - Aldrich nay thuộc về Merck (Hoa Kỳ).
- Kit resistin theo phương pháp enzyme miễn dịch là phương pháp định lượng in vitro để phát hiện peptid resistin dựa trên nguyên lý thử nghiệm cạnh tranh enzyme miễn dịch. Các microplate của Kit được phủ bằng kháng thể kháng huyết thanh thỏ. Sau bước chặn và phủ giếng bằng kháng thể kháng resistin, cả peptid resistin và peptid chuẩn trong mẫu được biotinyl hóa tương tác thay thế bằng kháng ngun resistin. Resistin biotinyl hóa khơng bị thay thế sẽ phản ứng với Streptavidin - horseradish peroxidase (SA-HRP), chất này xúc tác phản ứng tạo màu. Cường độ tín hiệu tạo màu trực tiếp theo tỷ lệ lượng phức hợp biotinylated peptideSA-HRP và tỷ lệ nghịch với lượng resistin trong dung dịch chuẩn hoặc trong mẫu thử. Do sự gắn cạnh tranh với kháng nguyên Resistin giữa biotinylated Resistin peptide và các peptid trong dung dịch chuẩn hoặc trong mẫu thử. Đường cong chuẩn của dung dịch mẫu đã biết nồng độ resistin được xác định và nồng độ Resistin trong mẫu thử sẽ được tính tốn dựa theo đường cong chuẩn.
- Nơi tiến hành: Phịng Thí nghiệm Sinh lý bệnh phân tử; Bộ môn Sinh lý bệnh - Học viện Quân y.
- Đơn vị tính: ng/ml.
* Các bước tiến hành:
Theo các bước tiến hành theo quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất; đọc nồng độ trên máy ELISA DAR 800 của hãng Diagnostic Automation (Mỹ):
- Lấy máu tĩnh mạch lúc đói; cùng thời gian lấy máu để định lượng insulin máu và glucose máu, tách và bảo quản mẫu theo hướng dẫn của Labo và hãng.
+ Chuẩn bị 8 ống nhựa eppendorf vô khuẩn 1,5 ml
+ Ống 1: Thêm 496 μl với 4μl dung dịch chuẩn được dung dịch có nồng độ chuẩn là 400 pg/ml.
+ Các ống 2, 3, 4, 5, 6, 7 mỗi ống cho vào 200 μl dung dịch pha mẫu. Sau đó tiếp tục pha lỗng bằng cách hút 200 μl dung dịch từ ống 1 sang ống 2 trộn đều, hút 200 μl dung dịch từ ống 2 sang ống 3 cứ tiếp tục như vậy cho
đến ống 7. Ống số 8 là dung dịch pha loãng mẫu. Như vậy sau q trình pha lỗng ta thu được các ống với nồng dộ lần lượt là: 400 pg/ml, 160 pg/ml, 64 pg/m, 25,6 pg/ml, 10,24 pg/ml, 4,1 pg/ml, 1,64 pg/ml và 0 pg/ml.
- Chuẩn bị mẫu và chuẩn: đặt về nhiệt độ phòng (18 – 250C): mẫu bệnh phẩm được
- Pha 100 μl chuẩn và mẫu vào từng giếng tương ứng; ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 2,5 giờ hoặc ủ qua đêm ở 40C có lắc nhẹ.
- Rửa 4 lần với dung dịch rửa 1x, thấm khô các giếng.
- Thêm 100 μl kháng thể gắn biotin vào mỗi giếng, ủ trong vịng 1 tiếng có lắc nhẹ nhàng.
- Lặp lại quy trình rửa như trước.
- Thêm 100 μl cơ chất TMB vào mỗi giếng, ủ trong 30 phút với điều kiện phòng tối.
- Thêm 50 μl dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng, Đọc kết quả ở bước sóng 450 nm.
- Tính toán kết quả: dựa vào đường cong chuẩn đo được của các giếng chuẩn với nồng độ đã biết trước.
50 l 50 l 50 l 50 l
1000 ng/mL 100 ng/mL 10 ng/m 1 ng/mL 100 pg/mL 0 pg/mL
Hình 2.1. Quy trình pha lỗng dung dịch chuẩn resistin
* Nguồn: theo Sigma – Aldrich (2015) [141]
Hình 2.2. Nguyên lý xét nghiệm và các bước định lượng resistin máu bằng
phương pháp ELISA
* Phân tích kết quả:
Kết quả được tính trung bình của mỗi bộ sao chuẩn, mẫu và chứng trừ đi khoảng trống quang học. Đồ thị đường cong chuẩn dùng phần mềm SigmaPlot software (hoặc phần mềm khác có khả năng phân tích 4 thơng số hồi quy logistic) với nồng độ chuẩn trên trục x và tỷ lệ % hấp thụ trên trục y (xem cách tính ở dưới). Vẽ đường cong phù hợp nhất qua điểm chuẩn. Phần trăm hấp thụ = (B- khoảng trống OD)/ (Bo-khoảng trống OD) B = OD của mẫu thử hoặc Bo chuẩn =OD của chuẩn zero (gắn hoàn toàn). Đường cong dữ liệu điển hình là để trình diễn. Đường cong chuẩn cần được xác định cho từng phép thử.
Hình 2.3. Phân tích kết quả nồng độ resistin EIA Peptide[141]
Sau đó quy đổi thành đơn vị ng/ml.
Hiện nay chưa có chỉ số tham chiếu về nồng độ resistin.
Nồng độ resistin người pg/ml Nồng độ resistin người pg/ml
Dung dịch thử nghiệm B Dung dịch thử nghiệm A
Kết quả xét nghiệm ở bệnh nhân được xác định là: Bình thường khi nồng độ resistin nằm trong khoảng > tứ phân vị dưới và nhỏ hơn tứ phân vị trên của nhóm chứng.
- Tăng khi nồng độ resistin lớn hơn phân vị trên của nhóm chứng. - Giảm khi nồng độ resistin nhỏ hơn phân vị dưới của nhóm chứng.
2.2.4.6. Định lượng nồng độ visfatin
¿Nguyên lý
- Nguyên lý: Phản ứng kết hợp kháng nguyên kháng thể kiểu sandwich. - Dựa trên phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể được gắn ở đáy giếng ELISA với kháng nguyên visfatin có trong huyết thanh bệnh nhân kết hợp với sự chuyển màu cơ chất đặc hiệu trong phản ứng ELISA. Sử dụng bộ kít xét nghiệm của hãng Sigma - Aldrich nay thuộc về Merck (Hoa Kỳ).
- Kit visfatin theo phương pháp enzyme miễn dịch là phương pháp định lượng in vitro để phát hiện peptid visfatin dựa trên nguyên lý thử nghiệm cạnh tranh enzyme miễn dịch. Các microplate của Kit được phủ bằng kháng thể kháng huyết thanh thỏ. Sau bước chặn và phủ giếng bằng kháng thể kháng visfatin, cả peptid visfatin được biotinyl hóa và peptid chuẩn trong mẫu tương tác thay thế bằng kháng nguyên visfatin. Visfatin biotinyl hóa khơng bị thay thế sẽ phản ứng với Streptavidin-horseradish peroxidase (SA-HRP), chất này xúc tác phản ứng tạo màu. Cường độ tín hiệu tạo màu trực tiếp theo tỷ lệ lượng phức hợp biotinylated peptide SA-HRP và tỷ lệ nghịch với lượng visfatin trong dung dịch chuẩn hoặc trong mẫu thử. Do sự gắn cạnh tranh với kháng nguyên visfatin giữa biotinylated visfatin peptide và các peptid trong dung dịch chuẩn hoặc trong mẫu thử. Đường cong chuẩn của dung dịch mẫu đã biết nồng độ visfatin được xác định và nồng độ visfatin trong mẫu thử sẽ được tính tốn dựa theo đường cong chuẩn.
* Các bước tiến hành
- Các bước tiến hành pha dịch chuẩn và các bước tiếp theo giống như các bước đã nêu trong phần định lượng resistin.
Hình 2.4. Nguyên lý xét nghiệm và các bước định lượng visfatin máu bằng
phương pháp ELISA[142]
- Nơi tiến hành: Phịng Thí nghiệm Sinh lý bệnh phân tử; Bộ môn Sinh lý bệnh - Học viện Quân y.
- Đơn vị tính: ng/ml.
50 l 50 l 50 l 50 l
1000 ng/mL 100 ng/mL 10 ng/m 1 ng/mL 100 pg/mL 0 pg/mL
Hình 2.5. Pha loãng dung dịch chuẩn visfatin
Mật độ quang học (OD) của các giếng được đo bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 450 nm, giá trị OD của các giếng ELISA tỷ lệ thuận với lượng visfatin có trong mẫu.
* Phân tích kết quả:
Kết quả được tính trung bình của mỗi bộ sao chuẩn, mẫu và chứng trừ đi khoảng trống quang học. Đồ thị đường cong chuẩn dùng phần mềm SigmaPlot software (hoặc phần mềm khác có khả năng phân tích 4 thơng số hồi quy logistic) với nồng độ chuẩn trên trục x và tỷ lệ % hấp thụ trên trục y (xem cách tính ở dưới). Vẽ đường cong phù hợp nhất qua điểm chuẩn. Phần trăm hấp thụ = (B- khoảng trống OD)/ (Bo-khoảng trống OD) B=OD của mẫu thử hoặc Bo chuẩn =OD của chuẩn zero (gắn hoàn tồn). Đường cong dữ liệu điển hình là để trình diễn. Đường cong chuẩn cần được xác định cho từng phép thử.
Sau khi loại bỏ các thành phần dư thừa không bám vào thành giếng; sự thay đổi hoạt tính của enzyme trong mỗi giếng tương ứng với sự có mặt của nhiều hay ít của các cytokine được phát hiện bằng cơ chất TMB. Sự đổi màu của cơ chất từ màu xanh sang màu vàng thể hiện sự có mặt của visfatin trong các giếng. Dung dịch hồ lỗng mẫu được dùng làm đối chứng.
Đơn vị đo của visfatin: ng/ml
Hình 2.6. Phân tích kết quả nồng độ visfatin EIA Peptide [142]
Hiện nay chưa có chỉ số tham chiếu về nồng độ Visfatin
Kết quả xét nghiêm ở bệnh nhân được xác định là: Bình thường khi nồng độ Visfatin nằm trong khoảng (TPV25-TPV75) của nhóm chứng
Dung dịch pha lỗngA Dung dịch pha lỗng B
Tăng khi nồng độ Visfatin >TPV75 của nhóm chứng Giảm khi nồng độ Visfatin < TPV25 của nhóm chứng