2.2 .PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.4.Kỹ thuật xử lý máu dây rốn
Nguyên lý
Máu dây rốn sau thu thập sẽ đƣợc xử lý với nhiều kỹ thuật chuyên sâu và phức tạp để loại bỏ bớt các thành phần thừa nhƣ hồng cầu, huyết tƣơng, giữ lại thành phần chính là lớp tế bào có nhân rất giàu tế bào gốc tạo máu. Điều đó sẽ giúp khối tế bào gốc đƣợc tinh sạch, thu gọn thuận tiện hơn cho việc lƣu trữ bảo quản.
Trong nghiên cứu này, máu dây rốn sau khi thu thập sẽ đƣợc xử lý theo phƣơng pháp ly tâm phân lớp theo tỷ trọng sử dụng Ficoll.
Tỷ trọng của Ficoll là 1.077, cao hơn tỷ trọng của tế bào đơn nhân nhƣng lại thấp hơn tỷ trọng của hồng cầu và bạch cầu hạt. Khi ly tâm, hồng
cầu và bạch cầu hạt lắng xuống đáy ống ly tâm, còn lớp buffy coat chứa tế bào gốc tạo máu, bạch cầu lympho và các tế bào đơn nhân khác nằm ở giữa lớp Ficoll và huyết tƣơng (Hình 2.3). Thu hoạch lớp buffy coat này sẽ thu đƣợc sản phẩm sau xử lý máu dây rốn chứa tế bào gốc tạo máu mong muốn.
Hình 2.3. Phân lớp các thành phần máu dây rốn trên một gradient Ficoll- Hypaque
Tóm tắt quy trình thực hiện
- Pha loãng máu dây rốn với dung dịch đệm DPBS, thao tác nhẹ nhàng tránh gây vỡ hồng cầu.
- Cho nhẹ nhàng máu đã pha loãng lên trên lớp ficoll có trong ống ly tâm với tỷ lệ thể tích 2:1.
- Ly tâm ống máu ở 400g trong 30 phút.
- Sau ly tâm, loại bỏ lớp huyết tƣơng phía trên cùng, thu lớp buffy coat ở giữa lớp huyết tƣơng và ficoll rồi cho sang ống ly tâm mới. - Rửa tế bào thu đƣợc 2 lần với DPBS.
- Lấy mẫu xét nghiệm vô khuẩn.
- Tế bào gốc từ máu dây rốn sau khi xử lý đƣợc trộn với dung dịch bảo quản, hạ nhiệt độ đạt dƣới -80°C, sau đó đƣợc bảo quản đông lạnh trong nitơ lỏng ở nhiệt độ -150 đến -196°C.
Tế bào gốc tạo máu sẽ đƣợc bảo tồn đầy đủ chức năng vốn có với thời gian lƣu giữ lâu dài. Hiện nay trên thế giới chƣa có tài liệu công bố thời gian tối đa khi lƣu giữ ở nhiệt độ âm sâu trong nitơ lỏng, vì vậy về lý thuyết có thể lƣu giữ không hạn chế về thời gian nếu có nhu cầu.
Khi cần dùng đến, chỉ cần đƣa tế bào gốc máu dây rốn về nhiệt độ cơ thể 37°C là có thể tiến hành sử dụng.