2.2 .PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.5. Kỹ thuật đánh giá chất lƣợng máu dây rốn sau xử lý
Nguyên lý
Lớp buffy coat chứa tế bào gốc tạo máu thu đƣợc sau khi xử lý máu dây rốn đƣợc tiến hành đánh giá chất lƣợng bằng phƣơng pháp đếm tế bào theo dòng chảy, sử dụng các chỉ thị CD34, CD45 để xác định quần thể CD34+
và TNC, sử dụng thuốc nhuộm 7AAD (7-Amino-actinomycin D) để xác định tỷ lệ tế bào sống.
a.Các tiêu chí xác định tế bào gốc/tiền thân tạo máu
Xác định tế bào gốc/tiền thân tạo máu ở ngƣời theo hƣớng dẫn của Hiệp hội Kỹ thuật ghép và Điều trị huyết học quốc tế (International Society of Hematotherapy and Graft Engineering – ISHAGE) [81] với các tiêu chí:
i) Biểu hiện kháng nguyên CD34
ii) Biểu hiện kháng nguyên CD45 với cƣờng độ nhuộm đặc trƣng của tế bào blast (tức là có thể phát hiện dễ dàng nhƣng ở mức độ thấp hơn so với bạch cầu lympho (Lymphocyte) và bạch cầu mono (Monocyte)
iii)Biểu hiện FSC (forward scatter) và SSC (side scatter) thấp.
Kháng nguyên CD34 là một họ các glycoprotein chuỗi đơn xuyên màng loại I đƣợc glycosyl hóa khác biệt đƣợc xác định lần đầu tiên vào năm 1984 trên tế bào gốc và tế bào tiền thân tạo máu [82]. Nó đƣợc biểu hiện trên hầu nhƣ tất cả các tế bào tiền thân tạo máu bao gồm cả tế bào gốc đa năng.
Mặc dù cấu trúc của CD34 đã đƣợc nghiên cứu kỹ lƣỡng, nhƣng vẫn còn tƣơng đối ít thông tin về chức năng của nó. Các nghiên cứu về tế bào gốc tạo máu cho thấy chúng có vai trò trong quá trình tăng sinh và biệt hóa tế bào. Ngoài ra có giả thuyết cho rằng CD34 đóng một vai trò trong việc vận chuyển HSC đến các hốc trong tủy xƣơng [83].
Các kháng thể đơn dòng nhận biết phân tử CD34 đƣợc phát triển và sử dụng trong phƣơng pháp đếm tế bào theo dòng chảy nhƣ một phƣơng tiện để đánh giá tế bào gốc tạo máu và tế bào tiền thân tạo máu.
c.Kháng nguyên CD45
Kháng thể CD45 nhận biết các thành viên trong họ CD45 gồm các kháng nguyên bạch cầu với trọng lƣợng phân tử là 180, 190, 210 và 220 kD, còn đƣợc gọi là bạch cầu kháng nguyên phổ biến (Leukocyte common antigen – LCA). Kháng nguyên bề mặt CD45 đƣợc biểu hiện trên mọi loại tế bào tạo máu trừ hồng cầu trƣởng thành và tiền thân trực tiếp của chúng [84].
d.Thuốc nhuộm 7-Amino-Actinomycin
Tế bào chết theo chƣơng trình, tế bào hoại tử và tế bào hƣ hỏng là những nguồn gây nhiễu trong việc phân tích các tế bào sống trong phƣơng pháp đếm tế bào theo dòng chảy. Các tế bào không sống (Nonviable cells) phải đƣợc đánh giá và phân biệt bằng phƣơng pháp sử dụng thuốc nhuộm 7- Amino-Actinomycin (7-AAD), từ đó xác định đƣợc tỷ lệ tế bào sống/chết trong quần thể tế bào quan tâm.
Thuốc nhuộm 7-AAD là một analog của actinomycin D có chứa nhóm amin đƣợc thay thế ở vị trí số 7 của nhóm mang màu (Chromophore) [85]. 7- AAD có ái lực mạnh với DNA, đi vào tế bào khi màng tế bào tổn thƣơng hay tế bào chết. 7-AAD xen vào giữa các gốc base cytosine và guanine của DNA. Actinomycin là hợp chất có hoạt tính sinh học có chứa nhóm mang màu gồm
một 2-amino-4, 6 dimethylphenoxazone-3 và hai cyclic pentapeptides. Actinomycin tạo phức bền vững với DNA sợi đôi, nhƣng không tạo với RNA, sợi lai RNA-DNA hay với DNA, RNA sợi đơn.
Đặc tính quang phổ của 7-AAD làm cho phân tử này đặc biệt thích hợp cho phƣơng pháp đếm tế bào theo dòng chảy. Phức hợp 7-AAD/DNA hấp thụ bƣớc sóng tối đa trong vùng quang phổ màu xanh lá cây, do đó phù hợp với máy đếm tế bào theo dòng chảy đƣợc trang bị đèn laser argon (bƣớc sóng kích thích 488nm) [85]. Sự phát xạ huỳnh quang màu đỏ đậm của thuốc nhuộm 7- AAD (635 đến 675nm) làm cho việc sử dụng màu nhuộm này dễ dàng hơn khi kết hợp với các kháng thể liên hợp huỳnh quang isothiocyanate (FITC) và phycoerythrin (PE), do phức hợp 7-AAD/DNA cho thấy sự chồng chéo quang phổ tối thiểu với FITC và PE [86]. Do đó, giảm bớt đƣợc thao tác bù màu (Compensation) trƣớc khi chạy mẫu, tiết kiệm hóa chất và thời gian.
e.Stem-count Fluorospheres
Stem-count Fluorospheres hay Flow-count Fluorospheres gồm có các vi cầu (Microsphere) huỳnh quang polystyrene đƣờng kính 10µm trong môi trƣờng huyền phù, chất hoạt động bề mặt và 1% formaldehyde. Mỗi hạt huỳnh quang có chứa chất nhuộm màu có dải phát huỳnh quang từ 525nm đến 700nm khi kích thích ở bƣớc sóng 488nm. Nồng độ thử nghiệm của Stem- count Fluorospheres (fluorospheres/µL) đƣợc lấy từ nhiều lần phân tích lặp lại bằng cách sử dụng máy phân tích kích thƣớc hạt COULTER. Giá trị cụ thể đƣợc ghi trên nhãn lọ. Bằng cách dựa trên giá trị này khi đếm tế bào theo dòng chảy có thể xác định đƣợc số lƣợng tế bào tuyệt đối nếu sử dụng một nồng độ cụ thể.
Tóm tắt quy trình thực hiện
- Chuẩn bị mẫu và hóa chất:
Mẫu tế bào thu đƣợc sau khi xử lý máu dây rốn pha loãng với đệm DPBS
Chuẩn bị ống chạy mẫu và ống đối chứng. Cho mẫu vào tất cả các ống.
- Ủ mẫu với kháng thể:
Bổ sung kháng thể CD34/CD45 vào ống chạy mẫu, kháng thể CD45 vào ống đối chứng (Bảng 2.4)
Bổ sung 7AAD vào tất cả các ống
Vortex và ủ mẫu trong điều kiện tối ở nhiệt độ phòng - Ly giải hồng cầu:
Sau thời gian ủ, bổ sung dung dịch đệm ly giải hồng cầu vào tất cả các ống
Vortex và ủ mẫu trong điều kiện tối ở nhiệt độ phòng - Sau khi ủ, bổ sung Stem-count flourospheres vào tất cả các ống. - Bật máy và chọn chƣơng trình phù hợp tiến hành chạy mẫu.
Bảng 2.4. Tóm tắt thông tin nhuộm mẫu với kháng thể
Hóa chất/Mẫu Ống mẫu 1 Ống mẫu 2 Đối chứng
CD45-FITC/CD34-PE 20µL 20µL
CD45-FITC 20µL
7-AAD viability dye 20µL 20µL 20µL
Mẫu tế bào 100µL 100µL 100µL
Vortex - ủ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút. Tránh ánh sáng
1x NH4Cl Lysing solution 2mL 2mL 2mL
Vortex - ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Tránh ánh sáng
Stem-count Flourospheres 100µL 100µL 100µL
- Phân tích kết quả thu đƣợc:
Chọn quần thể dƣơng tính với CD45, CD34
Trên cửa sổ 7-AAD, xác định quần thể tế bào âm tính với 7- AAD là quần thể tế bào sống
2.3.6. Kiểm soát nhiễm khuẩn mẫu máu dây rốn sau xử lý
Mẫu máu dây rốn sau khi xử lý đƣợc phát hiện ngoại nhiễm vi khuẩn, vi nấm đƣợc thực hiện dựa trên xét nghiệm vi khuẩn vi nấm nuôi cấy định danh và kháng thuốc trên hệ thống tự động BACT/ALERT® (BioMérieux, Pháp) với hai loại môi trƣờng lỏng khác nhau BacT/ALERT® FA Plus và BacT/ALERT® FN Plus (BioMérieux, Pháp) trong thời gian 14 ngày. Hệ thống cấy tự động đánh giá sự thay đổi nồng độ CO2 và N cũng nhƣ độ đục trong chai chấy mỗi 15 phút. Khi hệ thống báo dƣơng tính hoặc âm tính, các chai đƣợc đánh giá độ đục và nhuộm Gram để phát hiện sự hiện diện của tế bào vi khuẩn, vi nấm sau nuôi cấy trên hệ thống. Trong trƣờng hợp hệ thống báo dƣơng tính hoặc phát hiện tế bào vi khuẩn, vi nấm bằng nhuộm Gram, môi trƣờng lỏng đƣợc chuyển sang môi trƣờng đặc gồm Thạch máu (Blood Agar Base + 5% Sheep Blood), thạch Chocolate, MacConkey, Chapman, Sabouraud (MELAB, Việt Nam) để phát hiện sự hiện diện của khuẩn lạc vi khuẩn, vi nấm trong thời gian 2 ngày. Khi có khuẩn lạc vi khuẩn, vi nấm trên môi trƣờng đặc đƣợc định danh và thử nghiệm nhạy kháng sinh bằng hệ thống tự động VITEK 2 (BioMérieux, Pháp).
2.3.7. Phân tích thống kê
Thống kê mô tả đƣợc sử dụng cho các yếu tố ngƣời mẹ, yếu tố trẻ sơ sinh, yếu tố trong xử lý mẫu và các chỉ số chất lƣợng máu dây rốn.
Sự khác biệt giữa các yếu tố ảnh hƣởng về các chỉ số chất lƣợng tế bào gốc dây rốn đƣợc đánh giá bằng cách sử dụng kiểm kiểm định ANOVA.
Mối tƣơng quan giữa các các yếu tố ảnh hƣởng và các chỉ số chất lƣợng tế bào gốc dây rốn đƣợc kiểm tra bằng tƣơng quan Pearson
(Pearson’s correlation). Khi xác định 2 biến có mối tƣơng quan tuyến tính, xem xét độ mạnh/yếu của mối tƣơng quan này thông qua giá trị tuyệt đối của hệ số tƣơng quan r. Theo Andy Field [87]:
|r| < 0.1: mối tƣơng quan rất yếu
|r| < 0.3: mối tƣơng quan yếu
|r| < 0.5: mối tƣơng quan trung bình
|r| ≥ 0.5: mối tƣơng quan mạnh
r dƣơng – tƣơng quan thuận
r âm – tƣơng quan nghịch
Sử dụng phân tích hồi quy đơn biến và đa biến để kiểm tra sự ảnh hƣởng của từng yếu tố đến chất lƣợng sản phẩm tế bào gốc từ máu dây rốn (số lƣợng TNC, CD34+, tỷ lệ tế bào sống).
Khoảng tin cậy đƣợc sử dụng là 95% (p<0.05).
Tất cả các phân tích đƣợc thực hiện trên phần mềm phân tích thống kê IBM SPSS Statistic 22.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1.1. Kết quả thu thập mẫu
Bảng 3.1. Thống kê các đơn vị máu dây rốn đƣợc tiến hành thu thập
Đơn vị máu dây rốn n %
Tổng số 355 100
Loại 333 93.8
Không đạt tiêu chuẩn 22 6.2
Tổng số mẫu bị loại 22 100
Nguyên nhân bị loại
Thể tích máu < 70mL 17 77.3
Nhiễm khuẩn* 2 9.1
Sốt trong khi sinh 1 4.5
Dƣơng tính** 2 9.1
* Xét nghiệm vi sinh kiểm tra tính vô trùng của mẫu tế bào gốc sau khi đơn vị máu dây rốn đƣợc xử lý.
** Xét nghiệm virus HIV (HIV - ½ Ab), HBV (HbsAg, HbcAb), HCV (HCV Ab), Cytomegalo virus (CMV) IgM, giang mai (Syphilis), Rubella âm tính cho sản phụ trong vòng 7 ngày trƣớc sinh.
Trong khoảng thời gian từ tháng 06/2019 đến tháng 03/2021, tổng số 355 đơn vị máu dây rốn đƣợc thu thập tại Ngân hàng tế bào gốc, Bệnh viện đa khoa Tâm Anh, Hà Nội. Trong đó, số đơn vị đạt tiêu chuẩn sàng lọc đƣợc xử lý và lƣu trữ là 333 đơn vị, chiếm 93.8%. Số đơn vị máu dây rốn không đạt tiêu chuẩn sàng lọc có 22 đơn vị, chiếm 6.2% trong tổng số.
Trong số các đơn vị máu dây rốn bị loại, nguyên nhân bị loại do thể tích máu dƣới 70mL không bao gồm chất chống đông có 17 đơn vị chiếm 77.3%, còn lại là do các nguyên nhân khác nhƣ sản phụ sốt > 38o
C trong khi sinh (4.5%), xét nghiệm sản phụ dƣơng tính với một trong bảy xét nghiệm bệnh truyền nhiễm (9.1%) và xét nghiệm vi sinh cho kết quả dƣơng tính sau khi xử lý mẫu (9.1%).
3.1.2. Đặc điểm thống kê các đơn vị máu dây rốn đạt tiêu chuẩn
a) Đặc điểm sản phụ
Tuổi sản phụ
Bảng 3.2. Đặc điểm về độ tuổi của sản phụ
Cỡ mẫu (n) Nhỏ nhất Lớn nhất Trung bình Độ lệch chuẩn Tuổi sản phụ 333 18 48 32 5
Thống kê cho thấy, trong các đơn vị máu dây rốn đạt tiêu chuẩn, độ tuổi sản phụ trung bình 32±5 tuổi, trong đó, độ tuổi thấp nhất là 18 và cao nhất là 48 tuổi (Bảng 3.2).
Quan sát phân bố độ tuổi của sản phụ (Hình 3.1) cho thấy phần lớn sản phụ nằm trong độ tuổi từ 26-35 tuổi, chiếm tỷ lệ 57.36%. Sản phụ trên 46 tuổi chiếm tỷ lệ thấp nhất (0.3%), độ tuổi sản phụ từ 18-25 cũng chiếm tỷ lệ không nhiều (12.31%).
Đặc điểm sản khoa
Bảng 3.3. Đặc điểm sản khoa
Yếu tố n %
Tiền sử thai sản
Sinh con lần đầu 111 33.3
Sinh con ≥ 2 lần 188 56.5
Không xác định 34 10.2
Số lƣợng thai
Sinh một 314 94.3
Sinh đôi 19 5.7
Phƣơng pháp mang thai
Tự nhiên 255 76.6
Thụ tinh nhân tạo 78 23.4
Phƣơng pháp sinh
Sinh thƣờng 74 22.2
Sinh mổ 259 77.8
Kết quả cho thấy, nhóm sản phụ sinh con lần thứ 2 trở lên chiếm tỷ lệ cao 56.5%, chủ yếu là thai một chiếm 94.3%, tỷ lệ sinh đôi chiếm 5.7%. Ngoài ra tỷ lệ sản phụ sinh mổ 77.8% lớn hơn nhiều so với sinh thƣờng 22.2%. Đặc biệt, tỷ lệ sản phụ mang thai nhờ phƣơng pháp thụ tinh nhân tạo chiếm tỷ lệ đáng kể 23.4% (Bảng 3.3).
b) Đặc điểm trẻ sơ sinh
Giới tính trẻ sơ sinh
Trong số các đơn vị máu dây rốn đƣợc thu thập đạt tiêu chuẩn, nhóm trẻ sơ sinh giới tính nam chiếm tỷ lệ 61.93%, cao hơn đáng kể so với nhóm trẻ giới tính nữ chỉ chiếm 38.07% (Hình 3.2).
Hình 3.2. Phân bố giới tính trẻ sơ sinh
Tuổi thai và cân nặng
Bảng 3.4. Đặc điểm thống kê tuổi thai và cân nặng trẻ sơ sinh
Cỡ mẫu
(n) Nhỏ nhất Lớn nhất Trung bình
Độ lệch chuẩn Tuổi thai (tuần) 332 29 41 38.6 1.7
Hình 3.3. Phân bố tuổi thai
Thống kê cho thấy tuổi thai trung bình 38.6 ± 1.7 tuần (Bảng 3.4), nhóm tuổi thai ≥ 37 tuần chiếm tỷ lệ lớn nhất 87.95%, thấp nhất ở nhóm 29- 34 tuần tuổi chiếm 2.71% (Hình 3.3).
Về cân nặng trẻ sơ sinh, cân nặng trung bình đạt 3115±453g (Bảng 3.4). Quan sát phân bố cân nặng nhận thấy nhóm trẻ có cân nặng ≥ 3000 chiếm tỷ lệ 59.64% lớn hơn đáng kể so với nhóm trẻ có cân nặng từ 1300- 3000g (Hình 3.4).
c) Đặc điểm chỉ số chất lượng máu dây rốn
Bảng 3.5. Đặc điểm thống kê của các chỉ số chất lƣợng máu dây rốn đạt tiêu chuẩn sau khi xử lý
Chỉ số Cỡ mẫu (n) Nhỏ nhất Lớn nhất Trung bình Độ lệch chuẩn Thể tích (mL) 333 70 216 112 25 Tế bào sống (%) 333 72.2 99.6 95.7 4.2 TNC (x108 tế bào) 333 0.21 9.27 2.72 1.5 CD34+ (x106 tế bào) 333 0.15 12.31 2.31 1.86 Tỷ lệ CD34+ (%) 333 0.1 5.58 0.90 0.63 Thời gian bảo quản (phút) 316 19 2990 471.88 419.319
Hình 3.5. Phân bố thể tích máu dây rốn của các đơn vị đƣợc thu thập Từ Bảng 3.5 cho thấy các đơn vị máu dây rốn có thể tích máu trung Từ Bảng 3.5 cho thấy các đơn vị máu dây rốn có thể tích máu trung bình 112 ± 25mL. Trong đó, các đơn vị máu dây rốn có thể tích trong khoảng 100-129mL chiếm tỷ lệ lớn nhất 47.45%, các đơn vị máu có thể tích trên 160mL chiếm tỷ lệ khá nhỏ, chỉ 4.8% (Hình 3.5).
Số lƣợng TNC sau khi máu dây rốn đƣợc xử lý trung bình đạt 2.72±1.5x108 tế bào (Bảng 3.5). Quan sát phân bố số lƣợng TNC so với ngƣỡng 5x108 tế bào cho thấy, số đơn vị máu dây rốn có số lƣợng TNC ≥ 5x108 tế bào chiếm 7.21% (Hình 3.6).
Hình 3.7. Phân bố số lƣợng tế bào CD34+
Số lƣợng tế bào biểu hiện chỉ thị bề mặt CD34 trung bình đạt 2.31±1.86x106 tế bào, tỷ lệ CD34+ trung bình 0.90±0.63% (Bảng 3.5). Thống kê sự phân bố số lƣợng tế bào CD34+
cho thấy số đơn vị máu dây rốn có số lƣợng CD34+
Hình 3.8. Phân bố tỷ lệ tế bào sống
Tỷ lệ tế bào sống trung bình đạt 95.7 ± 4.2% (Bảng 3.5). Tỷ lệ tế bào sống ≥ 85% chiếm chủ yếu với 98.8%, đơn vị máu dây rốn có tỷ lệ tế bào sống <85% chỉ chiếm 4.2% (Hình 3.8).
3.1.3.Các yếu tố liên quan đến chỉ số chất lƣợng tế bào gốc tạo máu
a) Các yếu tố sản phụ và trẻ sơ sinh với thể tích máu dây rốn
Bảng 3.6. Một số yếu tố liên quan với thể tích máu thu thập
Thể tích (mL) n Trung bình Độ lệch chuẩn Nhỏ nhất Lớn nhất p Tuổi ngƣời mẹ <30 >30 131 202 110.4 113.0 25.9 24.4 70 70 187 216 0.351 Tiền sử thai sản Sinh con lần 1 Sinh con ≥ 2 lần 111 118 108.6 114.1 23.3 25.4 70 70 180 216 0.062 Số lƣợng thai Sinh một Sinh đôi 314 19 112.6 101.8 1.4 3.5 70 79 216 150 0.009 * Phƣơng thức sinh Sinh thƣờng Sinh mổ 74 259 108.6 113.0 23.8 25.3 70 70 171 216 0.182 Phƣơng thức mang thai Tự nhiên IVF 255 78 112.2 111.2 25.2 24.5 70 75 216 208 0.758 Nhóm máu sản phụ O+ A+ B+ AB+ 130 58 127 18 108.7 112.6 114.6 115.3 21.9 26.3