CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU
2.1.1. Nguyên liệu
Vỏ trái cây họ Citrus vùng ĐBSCL bao gồm 03 loại như sau: - Bưởi da xanh (Citrus maximax)
- Chanh không hạt (Citrus latifolia) - Cam sành (Citrus sinensis).
Mẫu được thu hái trực tiếp tại nhà vườn ở các địa điểm trồng phổ biến trên địa bàn tỉnh Bến Tre, Cần Thơ, Hậu Giang; sử dụng để nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện chiết xuất, động học q trình, đánh giá chất lượng tinh dầu và khả năng kháng khuẩn-kháng oxi hóa.
2.1.2. Dụng cụ, thiết vị và hóa chất
Hóa chất thí nghiệm: Các hóa chất sử dụng trong đề tài được liệt kê
trong bảng 2.1:
Bảng 2. 1. Danh mục hóa chất
Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm: Dụng cụ thí nghiệm được sử dụng trong
đề tài được liệt kê trong bảng 2.2, bảng 2.3:
STT Tên hóa chất Số CAS Nhà sản
xuất
Độ tinh khiết
1 Sodium sulfate -
anhydrous 7757 – 82 - 6 Xilong 99 (%)
Bảng 2. 2. Danh mục dụng cụ thí nghiệm
STT Tên dụng cụ Loại Nhà sản xuất
1 Bình cầu đáy trịn 1000 mL, 29-32 Đức
2 Thiết bị sinh hàn 29-32 Đức
3 Nhánh chiết 29-32 Đức
4 Bercher 250ml Ấn Độ
5 Ống đong thủy tinh 10 mL Ấn Độ
6 Giá đỡ 25 x 16cm Trung Quốc
7 Kẹp sắt 17cm Trung Quốc
8 Nút cao su 29-32 Trung Quốc
9 Dây dẫn nhựa Việt Nam
2.1.3. Địa điểm và thời gian thí nghiệm
Nghiên cứu này được thực hiện tài phịng thí nghiệm Cơng nghệ và Môi trường thuộc Viện Kỹ thuật Công nghệ cao NTT, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành.
Thời gian thực hiện: từ tháng 3/2020 đến tháng 3/2021. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp thu nhận nguyên liệu
Bưởi da xanh, cam sành và chanh không hạt mua tại vườn trồng phổ biến trên địa bàn tỉnh Bến Tre, Cần Thơ và Hậu Giang được sử dụng làm nguyên liệu chính. Sau khi vận chuyển đến phịng thí nghiệm, ngun liệu được rửa sạch để ráo, tách lấy phần vỏ xanh của quả bằng dao gọt bén và hạn chế tối đa phần vỏ trắng vì vỏ trắng gần như khơng có tinh dầu. Sau đó tiến
hành các bước tiếp theo của quy trình thiết kế thí nghiệm. Nguyên liệu thu nhận được chưa sử dụng cho thí nghiệm được bảo quản lạnh ở nhiệt độ 4oC và chỉ sử dụng trong 3 ngày để đảm bảo tính đồng nhất của nguyên liệu.
2.2.2. Phương pháp chiết xuất tinh dầu
Thu nhận tinh dầu bằng phương pháp chưng cất theo quy trình của nhóm tác giả Đỗ Đình Nhật, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành (Asian
Journal of Chemistry, 2019) [58]. Tiến hành chưng cất 100g nguyên liệu/thí nghiệm ở nhiệt độ từ 130oC, thời gian 105 phút và tỉ lệ nguyên liệu với nước 2/1 (g/mL). Sau quá trình chưng cất, tinh dầu thu được sẽ được loại bỏ phần nước bởi muối khan Na2SO4 để thu được tinh dầu tinh khiết.
2.2.3. Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả
Phương pháp xác định hàm ẩm: Độ ẩm trong nguyên liệu tính theo:
% ẩm = [(m1 – m2)*100]/m1 Trong đó:
m1 (g): khối lượng nguyên liệu ban đầu, m2 (g): khối lượng nguyên liệu sau sấy.
Phương pháp xác định hiệu suất tinh dầu: Hiệu suất tinh dầu (%)
tính theo nguyên liệu:
Y (%) = ( v
m) × 100% Trong đó:
Y (%): hiệu suất trích ly tinh dầu, V (mL): thể tích tinh dầu thu được, m (g): khối lượng nguyên liệu.
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu mơ hình động học của q trình trích ly tinh dầu ly tinh dầu
Xây dựng các mơ hình động học phù hợp áp dụng trên quá trình chưng cất tinh dầu vỏ bưởi, vỏ cam, vỏ chanh dựa theo hai cơ chế:
(1) Rửa: tinh dầu thu được từ các bề mặt của nguyên liệu
(2) Khuếch tán: tinh dầu đi từ bên trong nguyên liệu ra bề mặt của nguyên liệu.
+ Khuếch tán không bị cản trở: liên quan đến túi tinh dầu bị vỡ, không bị cản trở bởi màng hoặc các rào cản khác có trong nguyên liệu
+ Khuếch tán cản trở: sự chuyển tinh dầu qua màng còn nguyên vện, không bị phá vỡ
Hai cơ chế này là cơ sở mơ hình động học của quá trình chiết xuất tinh dầu vỏ bưởi, vỏ cam, vỏ chanh gồm 04 mơ hình như sau:
Mơ hình rửa, khuếch tán (cản trở và khơng cản trở) đồng thời
(10) Mơ hình rửa và khuếch tán (khơng cản trở) đồng thời:
(7) Mơ hình rửa tức thời, theo sau là khuếch tán:
(8) Mơ hình động học bật nhất (mơ hình khơng có giai đoạn rửa):
(9) Với:
fw, fd1, fd2 : Phần tinh dầu trích ly thơng qua giai đoạn rửa, khuếch tán không cản trở và khuếch tán cản trở;
kw, kd1, kd2 : Hằng số tốc độ cho giai đoạn rửa, khuếch tán không cản trở và khuếch tán cản trở;
q (mL/100g) : Lượng tinh dầu thu được trong nguyên liệu đến thời điểm t;
q (mL/100g): Lượng tinh dầu được chưng cất cho đến khi bão hịa. Tính tốn thơng số: Các tham số của mơ hình:kw, kd1, kd2, fw, fd1, fd2, q và R2 được xác định bằng phương pháp hồi quy tuyến tính dựa vào các giá trị thực nghiệm dựa vào đồ thị tương quan q và t. Xử lý dữ liệu bằng phần mềm OriginPro 9.
Các giá trị thống kê được xác định như sau: Hệ số xác định:
Phần trăm độ lệch giữa lượng tinh dầu thu được tại thời điểm bão hòa và lượng tinh dầu tính tốn từ mơ hình:
q% =
Trong đó,
q∞, exp (%): là lượng tinh dầu thu được ở thực nghiệm;
q∞, cal (%): là lượng tinh dầu đạt được từ mơ hình bằng cách sử dụng phần mềm Origin 9;
q∞, mean (%): là giá trị trung bình của q∞; N: là hệ số quan trắc.
Từ kết quả tính tốn, tiến hành so sánh giữa 4 mơ hình động học dựa vào hệ số xác định R2, %q và hằng số tốc độ k, mơ hình động học sẽ được chọn để mô tả dữ liệu thực nghiệm của quá trình chưng cất tinh dầu vỏ Citrus bằng phương pháp chưng cất cũng như xác định cơ chế chiết xuất của vỏ Citrus quá trình chiết xuất nhanh hay chậm, hằng số tốc độ của q trình.
2.2.5. Phương pháp đánh giá thành phần hóa học của tinh dầu
Xác định thành phần hóa học của sản phẩm tinh dầu bằng phương pháp sắc kí khí khối phổ GC-MS. Sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS_Gas Chromatography Mass Spectometry) là một trong những phương pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao và được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp.
Tên thiết bị: GC Agilent 7890N, MS 5973 với cột HP5-MS, cột áp suất 9.3 psi.
Điều kiện thực hiện: khí He, tốc độ dịng chảy 1,0 ml/phút, chia 1:100 dịng, thể tích tiêm 1ul, nhiệt độ 250oC. Nhiệt độ lò ban đầu ở 50oC trong 2 phút, sau đó tăng lên 80oC ở 2oC/phút và chúng tăng lên 150oC ở 5oC/phút. Tiếp tục tăng lên 200oC ở 10oC/phút và tăng lên 300oC ở 20oC/phút trong 5 phút.
Thành phần tinh dầu được xác định như sau: Xác định thời gian lưu của các chất trên GC giống thời gian lưu của những chất đã biết trước Đối chiếu phổ khối lượng thu được với phổ gốc trong thư viện NIST, từ đó định danh các cấu tử có trong tinh dầu vỏ Citrus.
2.2.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại tinh dầu dầu
a. Các chủng vi khuẩn được sử dụng bao gồm:
Gram âm (−) Gram dương (+)
Escherichia coli ATCC 8739 Bacillus cereus 46 Salmonella enterica ATCC14028 Staphylococcus aureus ATCC 6538
b. Phương pháp khuếch tán đĩa thạch
biến trong các thí nghiệm, nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của dịch chiết dược liệu hiện nay phương pháp này được mô tả vào năm 1990 bởi Perez [59].
Cơ sở của phương pháp: Bơm mẫu thí nghiệm ở một nồng độ xác định vào giếng trên đĩa môi trường đã được trãi sẳn vi sinh vật trên bề mặt, sau đó ủ đĩa để vi sinh tăng trưởng và phát triển, trong quá trình này mẫu sẽ khuếch tán ra xung quanh giếng và ức chế sự tăng trưởng của vi sinh tạo nên vòng kháng khuẩn nếu mẫu thí nghiệm có tác dụng [60].
Trong q trình khảo sát, kích thước của vịng kháng khuẩn bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như nhiệt độ, thời gian, mơi trường,..Vì vậy cần phải cố định các yếu tố để đảm bảo kết quả là chính xác và khách quan, các yếu tố được cố định gồm: Môi trường Mueller Hinton Agar (MHA), thời gian ủ 16- 18h ở nhiệt độ 35 ± 2 ºC, mật độ vi khuẩn 108 CFU/ml [61].
Quy trình thực hiện:
Tất cả dụng cụ thí nghiệm và môi trường nuôi cấy được chuẩn bị và được hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút.
Hoạt hóa dịch khuẩn: Các chủng thử nghiệm được nuôi cấy lắc trong 5ml môi trường Mueller Hinton Broth (MHB) trong khoảng thời gian từ 18 - 20 giờ ở nhiệt độ 35 ± 2 ºC. Sau đó được hiệu chỉnh đến giá trị Mc Farland 0,5 tương đương 1 – 2,108 bằng nước muối sinh lý NaCl 0,9%,
Trãi đĩa: 100 µl dịch canh khuẩn nồng độ 108 CFU/ml được bơm vào đĩa thạch MHA sau đó trãi khuẩn đều lên bề mặt đĩa ni.
Trong thí nghiệm này đường kính giếng được sử dụng là 6mm, ứng với 50 l mẫu tinh dầu.
Tinh dầu được sử dụng ở nồng độ 100%.
Tetracylin nồng độ 0,25 mg/ml được sử dụng làm chứng dương.
Mức độ hoạt động được ghi nhận trong bốn cấp độ theo đường kính trong (D (mm)) của vùng ức chế, kết hợp đường kính của đĩa (6 mm):
+2 (hoạt động vừa phải, 10 mm ≤ D ≤14 mm) +1 (ít hoạt động, D ≤ 9 mm)
(-) (không hoạt động)
2.2.7. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của các loại tinh dầu tinh dầu
Phương pháp bắt gốc tự do 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)
Phương pháp thu nhận gốc tự do DPPH được sử dụng để xác định khả năng kháng oxy hóa của một hợp chất. Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào gốc tự do ổn định điển hình trên phân tử DPPH*, trong cấu trúc hóa học của phân tử DPPH tồn tại một electron tự do ở nguyên tử nitơ, gốc tự do này bền và ổn định đồng thời khi chất này tồn tại ở dạng gốc tự do hợp chất có màu tím đậm và dung dịch với dung mơi ethanol có độ hấp thu cực đại ở bước sóng ánh sáng tím 517nm [62, 63].
Đối với một đối tượng cần khảo sát về khả năng cho điện tử và kháng gốc tự oxy hóa tự do, khi thử với thuốc thử DPPH*, DPPH* sẽ có khuynh hướng nhận thêm một electron hoặc một nguyên tử hydro từ đối tượng cần kiểm tra để trở về trạng thái bền ban đầu. Khi đó màu tím đậm mất đi và chuyển sang màu vàng nhạt do sự tồn tại của gốc picryl trong phân tử. Thông qua sự giảm gốc oxy hóa tự do có thể gián tiếp xác định được khả năng kháng oxy hóa của đối tượng cần khảo sát nói chung và dược liệu thử nghiệm nói riêng [64].
Trong thí nghiệm đánh giá khả năng bắt gốc DPPH* mẫu đối chứng được sử dụng gồm dung môi pha loãng mẫu và dung dịch DPPH. Khi tiến hành xác định khả năng kháng oxy hóa của một chất cần phải có một đối tượng dùng làm chất chuẩn, thường được dùng là ascorbic axit (vitamin C).
Kết quả được tính dựa trên giá trị IC50, giá trị IC50 được hiểu là hàm
lượng mẫu trong 1ml dung dịch cần để làm giảm 50% DPPH so với ban đầu [65].
Quy trình thực hiện:
Thử nghiệm chống oxi hóa DPPH* được tiến hành theo phương pháp Bùi Thị Kim Lý và cộng sự với một vài sửa đổi [66]. Pha loãng cao chiết mẫu đến khoảng nồng độ phù hợp, hút 1 ml tinh dầu mẫu đã pha loãng với methanol vào ống nghiệm. Mẫu đối chứng thay tinh dầu bằng methanol. Sau đó, hút thêm vào ống nghiệm 1, ml dung dịch DPPH* 0.3 mM vào ống nghiệm và để trong bóng tối trong 30 phút ở nhiệt độ phịng. Sau đó đo độ hấp thụ quang học ở 517 nm trên máy quang phổ UV-Vis. Vitamin C (acid ascorbic) được sử dụng làm chất chuẩn để so sánh.
Hoạt tính khử gốc tự do DPPH* (IC %) được xác định dựa theo cơng thức:
Trong đó:
AbsC: Độ hấp thụ quang của mẫu đối chứng AbsT: Độ hấp thụ quang của mẫu thử
Kết quả được ghi nhận dựa trên giá trị %IC tại nồng độ pha loãng xác
định .
Phương pháp bắt gốc tự do 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6- sulphonic axit) (ABTS*)
Phương pháp này cũng là một trong những phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa của một chất hoặc hợp chất mang tính thường quy, phương pháp này được mô tả bởi Susannab L. Scott và cộng sự vào năm 1993 [67].
Cơ sở khoa học của phươp pháp ABTS* cũng tương tự như phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH. Tuy nhiên sự khác biệt là ABTS được sử dụng thử cần phải được oxy hóa để tạo thành dạng ABTS8* mang một electron tự do bởi potassium persulfate (K2S2O8), ABTS ở dạng gốc tự do có màu xanh lam hoặc xanh lục có độ hấp thụ tối ưu ở bước sóng 734 nm, khi nhận thêm điện tử electron trở về dạng ban đầu dẫn đến mất dần màu xanh, thơng qua đó chúng ta có thể đánh giá được khả năng kháng oxy hóa của đối tượng cần kiểm chứng [68].
Cũng như phương pháp DPPH* thì vitamin C cũng là chất sử dụng để làm chất đối chứng và các mẫu tinh dầu dược pha loãng đến nồng độ xác định và tính giá trị giá trị %IC và mẫu đối chứng cũng gồm dung mơi pha lỗng và dung dịch ABTS*.
Quy trình thực hiện:
Thử nghiệm chống oxi hóa ABTS* được tiến hành theo phương pháp của Phạm Hồng Ngọc Thùy và cộng sự. Dung dịch gốc tự do ABTS* được chuẩn bị bằng cách cho 10ml dung dịch ABTS nồng độ 7,4 mM vào 10ml dung dịch K2S2O8 nồng độ 2,6 mM rồi ủ trong bóng tối trong 24 h, sau đó pha loãng bằng ethanol rồi điều chỉnh độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 734 nm đến 1,1 ± 0,02. Pha loãng tinh dầu đến khoảng nồng độ phù hợp bằng methanol, hút 0,5ml cao chiết mẫu đã pha loãng vào ống nghiệm. Mẫu đối chứng thay tinh dầu bằng methanol. Sau đó, hút thêm vào ống nghiệm 1,5 ml dung dịch ABTS* (OD517 nm = 1,1 ± 0,02) vào ống nghiệm và để trong bóng tối trong 30 phút. Đo độ hấp thụ quang học ở 734 nm trên máy quang phổ
UV-Vis. Vitamin C (acid ascorbic) được sử dụng làm chất để so sánh.
Hoạt tính khử gốc tự do ABTS* (IC %) được xác định dựa theo cơng thức:
Trong đó:
AbsC: Độ hấp thụ quang của mẫu đối chứng AbsT: Độ hấp thụ quang của mẫu thử
Kết quả được ghi nhận dựa trên giá trị %IC tại nồng độ pha loãng xác định.
2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu
Tất cả các thí nghiệm được lặp lại ba lần và được trình bày dưới dạng độ lệch chuẩn. Độ lệch chuẩn của kết quả được tính bằng Microsoft Excel. Dữ liệu thực nghiệm được phân tích bằng phần mềm Origin 9.0.
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.3.1. Quy trình cơng nghệ q trình chiết xuất
Quy trình chiết tách tinh dầu Citrus (vỏ Bưởi, vỏ Cam, vỏ Chanh) bằng phương pháp chưng cất trực tiếp với nước theo sơ đồ hình 2.1:
Hình 2. 2. Quy trình chiết tách tinh dầu Citrus Thuyết minh quy trình: Thuyết minh quy trình:
Quy trình chưng cất tinh dầu vỏ Citrus được thể hiện trong hình 2.2. Nguyên liệu sau khi thu hoạch tiến hành xử lý sơ bộ, loại bỏ bụi bẩn, phần hỏng, và tách cẩn thận lấy phần vỏ xanh của Citurs (hạn chế tối thiểu phần thịt trắng của chanh, phần thịt chứa pectin, sơ vì khơng có hoặc có rất ít tinh dầu). Vỏ Citrus với lượng cân thích hợp tiến hành xử lý kích thước và cho vào bình cầu, lượng nước được thêm vào phù hợp với từng thí nghiệm. Thiết bị chưng cất sau đó được gia nhiệt bằng bếp lưới với mức nhiệt khảo sát. Thời gian chưng cất được tính từ thời điểm giọt chất lỏng đầu tiên xuất hiện. Hỗn hợp tinh dầu và nước sau khi đi qua thiết bị ngưng tụ được mang đi để thu hồi tinh dầu. Tinh dầu thu được với một ít nước nên được làm khan bằng muối Na2SO4, thu được tinh dầu tinh khiết.
2.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình chưng cất
Mục đích: Khảo sát các điều điều kiện chiết xuất thích hợp (tỉ lệ