CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại tinh dầu
Xác định thành phần hóa học của sản phẩm tinh dầu bằng phương pháp sắc kí khí khối phổ GC-MS. Sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS_Gas Chromatography Mass Spectometry) là một trong những phương pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao và được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp.
Tên thiết bị: GC Agilent 7890N, MS 5973 với cột HP5-MS, cột áp suất 9.3 psi.
Điều kiện thực hiện: khí He, tốc độ dịng chảy 1,0 ml/phút, chia 1:100 dịng, thể tích tiêm 1ul, nhiệt độ 250oC. Nhiệt độ lò ban đầu ở 50oC trong 2 phút, sau đó tăng lên 80oC ở 2oC/phút và chúng tăng lên 150oC ở 5oC/phút. Tiếp tục tăng lên 200oC ở 10oC/phút và tăng lên 300oC ở 20oC/phút trong 5 phút.
Thành phần tinh dầu được xác định như sau: Xác định thời gian lưu của các chất trên GC giống thời gian lưu của những chất đã biết trước Đối chiếu phổ khối lượng thu được với phổ gốc trong thư viện NIST, từ đó định danh các cấu tử có trong tinh dầu vỏ Citrus.
2.2.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại tinh dầu dầu
a. Các chủng vi khuẩn được sử dụng bao gồm:
Gram âm (−) Gram dương (+)
Escherichia coli ATCC 8739 Bacillus cereus 46 Salmonella enterica ATCC14028 Staphylococcus aureus ATCC 6538
b. Phương pháp khuếch tán đĩa thạch
biến trong các thí nghiệm, nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của dịch chiết dược liệu hiện nay phương pháp này được mô tả vào năm 1990 bởi Perez [59].
Cơ sở của phương pháp: Bơm mẫu thí nghiệm ở một nồng độ xác định vào giếng trên đĩa môi trường đã được trãi sẳn vi sinh vật trên bề mặt, sau đó ủ đĩa để vi sinh tăng trưởng và phát triển, trong quá trình này mẫu sẽ khuếch tán ra xung quanh giếng và ức chế sự tăng trưởng của vi sinh tạo nên vịng kháng khuẩn nếu mẫu thí nghiệm có tác dụng [60].
Trong q trình khảo sát, kích thước của vịng kháng khuẩn bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như nhiệt độ, thời gian, mơi trường,..Vì vậy cần phải cố định các yếu tố để đảm bảo kết quả là chính xác và khách quan, các yếu tố được cố định gồm: Môi trường Mueller Hinton Agar (MHA), thời gian ủ 16- 18h ở nhiệt độ 35 ± 2 ºC, mật độ vi khuẩn 108 CFU/ml [61].
Quy trình thực hiện:
Tất cả dụng cụ thí nghiệm và mơi trường nuôi cấy được chuẩn bị và được hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút.
Hoạt hóa dịch khuẩn: Các chủng thử nghiệm được ni cấy lắc trong 5ml môi trường Mueller Hinton Broth (MHB) trong khoảng thời gian từ 18 - 20 giờ ở nhiệt độ 35 ± 2 ºC. Sau đó được hiệu chỉnh đến giá trị Mc Farland 0,5 tương đương 1 – 2,108 bằng nước muối sinh lý NaCl 0,9%,
Trãi đĩa: 100 µl dịch canh khuẩn nồng độ 108 CFU/ml được bơm vào đĩa thạch MHA sau đó trãi khuẩn đều lên bề mặt đĩa ni.
Trong thí nghiệm này đường kính giếng được sử dụng là 6mm, ứng với 50 l mẫu tinh dầu.
Tinh dầu được sử dụng ở nồng độ 100%.
Tetracylin nồng độ 0,25 mg/ml được sử dụng làm chứng dương.
Mức độ hoạt động được ghi nhận trong bốn cấp độ theo đường kính trong (D (mm)) của vùng ức chế, kết hợp đường kính của đĩa (6 mm):
+2 (hoạt động vừa phải, 10 mm ≤ D ≤14 mm) +1 (ít hoạt động, D ≤ 9 mm)
(-) (không hoạt động)