❖ Các yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật
47 - Thường phát triển ở 15 – 45 oC - Thường chết ở 60 oC/20 phút, bào tử bị diệt ở 120 oC/30 – 40 phút - VSV cần nước để sống và phát triển - > giới hạn độ ẩm để hạn chế VSV phát triển - UV ở khoảng 260 nm diệt khuẩn mạnh nhất - UV có thể diệt hoặc gây đột biến ở VSV - Các chất diệt khuẩn, kháng sinh... - Nấm mốc tiết kháng sinh diệt khuẩn...
❖ Môi trường nuôi cấy vsv:
- Yêu cầu:
o Đầy đủ chất dinh dưỡng theo yêu cầu thí nghiệm o Có pH trong khoảng quy định
o Vô trùng
- Các loại môi trường:
o Môi trường tự nhiên: gồm nguyên liệu có nguồn gốc động vật hay thực vật
o Môi trường tổng hợp: gồm các hóa chất thuần khiết đã được quy định, thường hòa tan trong nước o Môi trường bán tổng hợp: = tự nhiên + tổng hợp
❖ Phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy vsv: - Chuẩn bị dụng cụ- hóa chất
- Cân đong nguyên liệu - Hòa tan nguyên liệu - Điều chỉnh pH
- Làm trong môi trường
- Đóng ống tiệt trùng. Thường tiệt trùng 110 oC/30 min hay 120 oC /20 min. Môi trường có thành phần kém bền với nhiệt: tiệt trùng bằng phương pháp Tyndall, Pasteur hay dùng lọc vi khuẩn.
→ Pha chế môi trường từ hỗn hợp bột môi trường chế sẵn: lưu ý đo lại pH để kiểm tra nếu môi trường đã cũ → Bảo quản môi trường bột khô: 10 -12 oC trong đk khô, tránh ánh sáng
→ Môi trường đã pha chế: bảo quản ở 4-10 oC trong 1-2 tháng tùy thành phần môi trường
❖ Các phương pháp tiệt trùng: (Phải chú ý về sự phân bổ không đồng đều của tác nhân diệt khuẩn trong buồn diệt khuẩn)
Nhiệt khô
- Dùng tiệt trùng dụng cụ thí nghiệm bền với nhiệt
- Sấy 180 oC/ 30 phút hay 170 oC/1 h hay 160 oC/2 h. Tủ sấy có gắn thiết bị đối lưu không khí.
- Tiệt khuẩn và khử chất gây sốt các dụng cụ thủy tinh thường tiến hành ở nhiệt độ cao hơn 220 °C.
48
Nhiệt ẩm (hơi nước)
- Tiệt trùng môi trường nuôi cấy và dụng cụ phẫu thuật - Dùng nồi hấp 121 oC/15 phút
- Phương pháp Tyndall (tiệt trùng gián đoạn) - Phương pháp Pasteur (khử trùng nhiệt độ thấp)
Lọc
- Dùng tiệt trùng các chất không bền với nhiệt
- Lỗ lọc ≤ 0.22 µm, có khả năng giữ lại 100 % vi khuẩn Pseudomonas diminuta trong điều kiện thí nghiệm thích hợp
- Phải tiệt trùng thiết bị lọc và màng lọc trước khi
Dùng tia bức xạ
- Thường dùng tia UV tiệt trùng buồng pha chế, tủ cấy vi sinh vật - Nguồn tia phải chiếu trực tiếp và vuông góc với nơi cần tiệt trùng - Ít diệt được nấm nên phải kết hợp với hóa chất tiệt khuẩn
- Các tia bức xạ ion hóa khác dùng tiệt khuẩn: tia gamma, chùm electron năng lượng cao. Liều hấp thu chuẩn 25 kGy.
Hóa học - Phun xịt hóa chất, xông khí (ethylene oxide)
❖ Mức đảm bảo vô khuẩn:
- Mức bảo đảm vô khuẩn SAL (sterility assurance level) của một qui trình tiệt khuẩn đã cho là xác suất tồn tại một đơn vị đóng gói không vô khuẩn trong toàn bộ lô sản phẩm sau khi tiệt khuẩn bằng qui trình đó.
Ví dụ: SAL=10-6 có nghĩa là có khả năng có không nhiều hơn một vi sinh vật sống trong 1 x 10-6 đơn vị đóng gói của sản phẩm đã tiệt khuẩn.
- Đối với một qui trình tiệt khuẩn đã cho, SAL phụ thuộc số lượng vi sinh vật có trong sản phẩm trước khi tiệt khuẩn, sức đề kháng của nó với tác nhân tiệt khuẩn và môi trường trong đó vi sinh vật tồn tại trong quá trình xử lý.
- SAL của mỗi qui trình tiệt khuẩn được thiết lập trong khi thẩm định qui trình. ❖ Chỉ thị sinh học dùng cho tiệt khuẩn
- Là những chế phẩm sinh học đã tiêu chuẩn hóa, được sản xuất từ các vi sinh vật chọn lọc, dùng để đánh giá hiệu quả của các qui trình tiệt khuẩn.
- Chỉ thị sinh học thường được sản xuất bằng cách cấy một lượng bào tử vi sinh vật chỉ thị lên vật mang trơ, ví dụ băng giấy lọc, bản mỏng thủy tinh hay ống plastic, sau đó đóng gói vật mang đã cấy khuấn vào bao bì thích hợp nhằm bảo vệ sản phẩm tránh bị biến chất và tạp nhiễm. Hỗn dịch bào tử vi khuẩn đóng trong ống thủy tinh kín cũng có thể được dùng làm chỉ thị sinh học
- Các thông kèm theo mỗi chỉ thị sinh học bao gồm: tên loài vi khuẩn dùng làm vi sinh vật đối chiếu, số (định danh loài của bảo tang giống gốc), số lượng bào tử sống trên mỗi vật mang, hạn dùng và trị số D. - Trị số D là tham số tiệt khuẩn (khoảng thời gian hoặc liều hấp thụ) cần để làm giảm lượng bào tử sống
xuống còn 10 % so với lượng ban đầu.
49
o Sức đề kháng của vi khuẩn chỉ thị đổi với phương pháp tiệt khuẩn đã cho phải lớn hơn sức đề kháng của tất cả các vi khuẩn gây bệnh và các vi khuẩn có khả năng nhiễm vào sản phẩm cần tiệt khuẩn;
o Không gây bệnh; o Dễ nuôi cấy.
Tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm: Chỉ thị sinh học được dùng là bào tử của vi khuẩn Bacillus stearothermophilus.
Tiệt khuẩn bằng nhiệt khô: Chỉ thị sinh học được dùng là bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis.
Tiệt khuẩn bằng bức xạ ion hóa: Thường dùng bào tử của Bacillus pumilus Tiệt khuẩn bằng chất khí: Với tác nhân tiệt khuẩn là ethylene oxide, thường dùng bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis
3. Phép thử vô trùng:
a. Mục đích:
- Phát hiện sự có mặt của vi khuẩn, vi nấm trong chế phẩm - Đối tượng: dịch truyền, thuốc tiêm, thuốc tra mắt, dụng cụ y tế